2012 Fiscal Year Research-status Report
磁性ナノ粒子プローブ－反応熱分解分析法による薬剤耐性菌の迅速検出法の開発
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23615007
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| Research Institution | Chubu University |
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Principal Investigator |
石田 康行 中部大学, 応用生物学部, 准教授 (70273266)
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| Keywords | 磁性粒子プローブ / 薬剤耐性菌 / 反応熱分解GC/MS / 有機アルカリ / リン脂質 / 脂肪酸 / MALDI-TOF/MS |
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| Research Abstract |
昨年度に開発した磁性ナノ粒子プローブと各種の質量分析法（MS）を連結した計測方法を発展的に応用して、実際の生体試料あるいは細菌混合系から、任意の細菌種の細胞膜脂質成分を構造キャラクタリゼーションする一連の実験を行った。
まず、マトリックス支援レーザー脱離イオン化MS（MALDI-MS）をMS装置に利用して、サルモネラ菌と大腸菌の混合系から、前者の細菌中の細胞膜脂質成分を選択的に解析する検討を行った。ここでは、サルモネラ菌に特異的に作用する抗体で表面修飾した磁性ビーズをプローブとして用いて、まずは当該混合系からビーズとサルモネラ菌の複合体を特異的に形成させた。この複合体をMALDI-MSにより解析したところ、サルモネラ菌を構成する各種リン脂質成分を高感度に検出でき、そのヘッドグループやアシル基などの分子構造を詳細に解明することが可能になった。
さらに、反応熱分解ガスクロマトグラフィ-/MS（反応熱分解GC/MS）をMSとして用いて、複雑な試料マトリックス中に存在する細菌試料を選択分析する検討を行った。ここでは、大腸菌を豚の血液中に人為的に添加したものを生体試料のモデルとして用い、そこに含まれる大腸菌の細胞膜脂質を構成する脂肪酸成分を高感度かつ選択的に検出することを試みた。様々な反応試薬，その濃度，および反応温度などの各種パラメーターを検討した結果，化学試薬として強有機アルカリの一種である水酸化テトラメチルアンモニウム（TMAH）を使用し，その濃度を25 w/w %，また反応温度を400℃に設定したときに，大腸菌に含有される脂肪酸成分を明瞭に検出することが可能になった。こうして得られた脂肪酸成分のピーク面積から、大腸菌の細胞膜を構成する脂肪酸成分の化学組成を、試料マトリックス成分に因る妨害を全く受けることなく、正確に解析することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画・方法に記載した通りに、磁性ナノ粒子プローブと反応熱分解分析法を組合わせた新規計測システムにより、1) 実際の生体試料（血液）からの特定の細菌種の選択的な捕集、および2) その細菌種の細胞膜脂質の詳細な構造キャラクタリゼーションを達成することができた。実際の薬剤耐性菌を対象とした実験は実施できなかったものの、当該粒子プローブでは、同族の菌種であれば薬剤耐性の有無にかかわらず、その捕集が可能であることがすでに知られている。それ故、自己評価として（2）を選択した。
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| Strategy for Future Research Activity |
新たに開発した磁性ナノ粒子プローブ－反応熱分解分析法が、実際の生体試料マトリックスを用いた実験系の計測に十分適用できることが、今年度、実証された。次年度は、この方法を発展的に応用して、生体マトリックス中の細菌試料における、薬剤耐性の有無の判定を行うことを試みる。具体的には、薬剤耐性菌を含む複数の菌種を人為的に添加した飲料水や血液などの実サンプルを試料に用いて、磁性ナノ粒子プローブ－反応熱分解GC/MS測定を行う。その結果得られる当該細菌の脂肪酸プロファイルを手掛かりに用いて、耐性作用を有する細菌の存在を迅速かつ簡便に決定できる計測システムの開発を目指す。
さらに、ここでは、コンピュータ支援されたバイオインフォマティックスの手法を活用して、脂肪酸プロファイルと薬剤耐性の有無との間の相関解析も実施する。この解析結果から、耐性作用の進行に伴う脂肪酸成分の組成や構図における変異の内容を精査し、最終的には薬剤耐性の発現メカニズムの一端を明らかにすることも目指す。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
該当なし
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