光による遺伝子発現制御の試み

2011 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 23650172
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 林 康紀 理化学研究所, 記憶メカニズム研究チーム, チームリーダー (90466037)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2012-03-31
• Keywords: LOVドメイン / 光遺伝学 / 遺伝子発現 / Creレコンビナーゼ

Research Abstract

Photoactivatable Creタンパク質を作成する為、LOVドメインとCreタンパク質を作成し、CMV-lox-stop-lox-GFPカセットを持つベクターとHEK細胞に共導入した。CMV-lox-stop-lox-GFPはCre活性によりlox-stop-loxが除かれると上流にあるCMV promoterの働きによりGFPを発現する様になる。また、光をいちいち当てずにも光活性化を検出する為、光を当てた状態のLOVを模倣するI539E変異体、並びに光を当てていない状態を模倣するC450A変異体を融合したCreを作成し、両者での活性の際を観察した。LOVドメインは、CreのC末端、並びにN末端に融合し、またその長さをCreの結晶構造を参考に、ぎりぎりまで削ったものから、1アミノ酸ずつ、15アミノ酸までの異なった長さにものを作成した。その結果、殆どの構築でGFPの蛍光が見られた、つまりLOVドメインによるCre活性の抑制が見られなかった。恐らく、ごく少数のCre分子が、活性化されただけでもlox-stop-loxを除いてしまい、GFPの転写が起こってしまうと考えられた。これを解決する為、Cre-LOVドメイン融合蛋白の発現プラスミド量をごく少量にするなどの工夫を行なったが、残念ながらI539E変異体でGFPの発現が見られ、C450A変異体で見えないような融合蛋白は無かった。しかし、一部のタンパク質でGFPがその他よりも暗いものが認められ、Cre活性の抑制が掛かっている可能性がある。そこで、今後はその構築を中心に、結合部位に変異を入れて、両者で差があるものが得られないか検討していく。

Research Products

• [Journal Article] A rapid and effective FISH protocol with hybridization-sensitive fluorescent linear oligo probes (2012)
  • Author(s): Wang, D. O., Matsuno, H., Ikeda, S., Nakamura, A., Yanagisawa, H., Hayashi, Y., Okamoto, A
  • Journal Title: RNA Volume: 18 Pages: 166-175
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural plasticity of dendritic spines (2011)
  • Author(s): Bosch, M., Hayashi, Y
  • Journal Title: Curr. Opin. Neurobiol
  • DOI: doi:10.1016/j.conb.2011.09.002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Experience-dependent regulation of CaMKII activity within single visual cortex synapses in vivo (2011)
  • Author(s): Mower, A.F., Kwok, S.M., Yu, H., Majewska, A.K., Okamoto, K.-I., Hayashi, Y.*, Sur, M.*(*:co-corresponding authors)
  • Journal Title: Proc.Natl.Acad.Sci. Volume: 108 Pages: 21241-21246
  • DOI: 10.1073/pnas.1108261109
  • Peer Reviewed
• [Presentation] The role of CaMKII beta in modulating dendritic spine structural plasticity (2011)
  • Author(s): Lakhanpal, G., Kim, K., Kato-Hayashi, M., Hayashi, Y., Okamoto, K.
  • Organizer: SfN 2011
  • Place of Presentation: Washington DC, USA
  • Year and Date: 2011-11-16
• [Presentation] CaMKII gates rapid structural plasticity in hippocampal dendritic spines (2011)
  • Author(s): Kim, K., Hayashi, M., Narayanan, R., Suzuki, A., Matsuura, K., Okamoto, K., Hayashi, Y.
  • Organizer: SfN 2011
  • Place of Presentation: Washington DC, USA
  • Year and Date: 2011-11-16
• [Presentation] A quantitative anyalysis of AMPA receptor GluR1 phospho-isotypes (2011)
  • Author(s): Hosokawa, T., Hayashi, Y.
  • Organizer: SfN 2011
  • Place of Presentation: Washington DC, USA
  • Year and Date: 2011-11-15
• [Presentation] Structural roles of CaMKII (2011)
  • Author(s): Hayashi, Y.
  • Organizer: 日本神経化学会
  • Place of Presentation: 金沢(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-26
• [Presentation] In vivo two-photon imaging of neuronal circuit activity using transgenic mice that express fluorescent calcium sensor proteins in the brain (2011)
  • Author(s): Sato, M., Kawano, M., Islam, T., Yamaguchi, Y., Ohkura, M., Nakai, J., Hayashi, Y.
  • Organizer: 第34回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2011-09-16
• [Presentation] A quantitative anyalysis of AMPA receptor GluR1 phospho-isotypes (2011)
  • Author(s): Hosokawa, T., Hayashi, Y.
  • Organizer: 第34回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2011-09-15
• [Presentation] The regulation of dendritic spine structural plasticity by CaMKII beta (2011)
  • Author(s): Lakhanpal, G.K., Kim, K., Kato-Hayashi, M., Hayashi, Y., Okamoto, K
  • Organizer: 8^<th> IBRO World Congress of Neuroscience
  • Place of Presentation: Florence, Italy
  • Year and Date: 2011-07-15
• [Presentation] Phosphoisotype analysis of AMPA receptor GluR1 (2011)
  • Author(s): Yasunori Hayashi
  • Organizer: Gordon Research Conference Excitatory Synapses & Brain Function
  • Place of Presentation: Easton, MA, USA(招待講演)
  • Year and Date: 2011-06-29
• [Remarks]
  • URL: http://glutamate.brain.riken.jp