2011 Fiscal Year Research-status Report
細胞周期特異的デグロンによる蛋白質発現制御と機能解析への応用
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23651046
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
高田 穣 京都大学, 放射線生物研究センター, 教授 (30281728)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | DNA修復 / DNA損傷チェックポイント / Treslin / Geminin / Cdt1 / 細胞周期特異的デグロン |
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| Research Abstract |
１．ニワトリCdt1とGemininのデグロン配列の同定。FUCCIの構造と、従来明らかにされたCdt1とGeminin分解の分子機構を参考に、ニワトリCdt1とGeminin配列からデグロン配列候補の同定を試みた。Cdt1もGemininも、ヒトとニワトリの配列の保存性が、特にデグロンを含む部分においてそれほど高くないため、ニワトリCdt1と、Gemininの配列を比較しデグロン配列の候補を同定した。実際にニワトリCdt1（アミノ酸配列1-499）、Cdt1 （150-499）、Geminin（1-110）をそれぞれクローニングし、 GFP融合型デグロン発現ベクターを作成した。２．デグロン配列の機能検証。作成したGFP融合型デグロン発現ベクターを野生型DT40にstableに導入し、発現細胞の単離を行った。現在、デグロンのGFP発現量の細胞周期依存的制御について検討を行っている。発現量があまり多くなく、難航している。３．Treslin/ticrr遺伝子のコンディショナルノックアウト細胞作成。最近、チェックポイント因子であるTopBP1遺伝子の会合因子として、またゼブラフィッシュのチェックポイント変異体の同定の試みから、Treslin/ticrr遺伝子が新規に同定された（Cell 140:349, 2010; Genes & Dev 24:183, 2010）。この遺伝子は、酵母の複製開始の必須因子で、CDKのリン酸化基質であるSld3と限定的なホモロジーを持つ (Curr Biol 20:R509, 2010)。このTreslin/ticrr遺伝子を、オーキシン誘導性デグロン（AID）の系を用いたコンディショナルノックアウト細胞として作成した。現在その表現型の解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
デグロン融合型のGFPの発現は可能であったが、そのレベルは高くなく、細胞周期特異的なGFPの分解がはっきりと検出できていない。そのため、デグロンとしての有用性が評価困難となっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ニワトリDT40細胞において十分な発現が得られないとすれば、現在使用している配列をさらに絞り込んでよく発現させる可能性がある。また、GFPを二つタンデムに結合して、より蛍光強度をあげ、検出感度を高める可能性がある。また、すでにほ乳類細胞でFucciの細胞周期特異的発現は成功しているので、系をほ乳類細胞とし、Fucciで使用されたGeminin とCdt1のデグロン配列を用いて、細胞周期特異的に特定因子発現を行う可能性がある。次年度はこれらの可能性について検討していく。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
上記のように、研究の進行がやや遅れたため、使用されず残った研究費が出た。次年度は、この費用も含めて研究を進展させていく。すべて消耗品として使用する予定である。
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Research Products
(23 results)
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[Journal Article] ATR-Chk1 signaling pathway and homologous recombinational repair protect cells from 5-fluorouracil cytotoxicity.2012
Author(s)
Fujinaka Y, Matsuoka K, Iimori M, Tuul M, Sakasai R, Yoshinaga K, Saeki H, Morita M, Kakeji Y, Gillespie DA, Yamamoto KI, Takata M, Kitao H, Maehara Y.
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Journal Title
DNA Repair (Amst).
Volume: 11
Pages: 247-58
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] ATR-ATRIP kinase complex triggers activation of the Fanconi anemia DNA repair pathway.2012
Author(s)
Shigechi T, Tomida J, Sato K, Kobayashi M, Eykelenboom JK, Pessina F, Zhang Y, Uchida E, Ishiai M, Lowndes NF, Yamamoto K, Kurumizaka H, Maehara Y, Takata M.
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Journal Title
Can Res
Volume: 72
Pages: 1149-1156
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Predisposition to cancer caused by genetic and functional defects of Mammalian atad52011
Author(s)
BellDW, Sikdar N, Lee KY, Price JC, Chatterjee R, Park HD, Fox J, Ishiai M, Rudd ML, Pollock LM, Fogoros SK, Mohamed H, Hanigan CL; NISC Comparative Sequencing Program, Zhang S, Cruz P, Renaud G, Hansen NF, Cherukuri PF, Borate B, McManus KJ, Stoepel J, S
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Journal Title
PLoS Genet
Volume: 7(8)
Pages: e1002245
DOI
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[Remarks] １/Welcome.html
