細胞周期特異的デグロンによる蛋白質発現制御と機能解析への応用

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23651046
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 高田 穣 京都大学, 放射線生物研究センター, 教授 (30281728)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2013-03-31
• Keywords: DNA修復 / DNA損傷チェックポイント / Treslin / Geminin / Cdt1 / 細胞周期特異的デグロン

Research Abstract

１．ニワトリCdt1とGemininのデグロン配列の同定。FUCCIの構造と、従来明らかにされたCdt1とGeminin分解の分子機構を参考に、ニワトリCdt1とGeminin配列からデグロン配列候補の同定を試みた。Cdt1もGemininも、ヒトとニワトリの配列の保存性が、特にデグロンを含む部分においてそれほど高くないため、ニワトリCdt1と、Gemininの配列を比較しデグロン配列の候補を同定した。実際にニワトリCdt1（アミノ酸配列1-499）、Cdt1 （150-499）、Geminin（1-110）をそれぞれクローニングし、 GFP融合型デグロン発現ベクターを作成した。２．デグロン配列の機能検証。作成したGFP融合型デグロン発現ベクターを野生型DT40にstableに導入し、発現細胞の単離を行った。現在、デグロンのGFP発現量の細胞周期依存的制御について検討を行っている。発現量があまり多くなく、難航している。３．Treslin/ticrr遺伝子のコンディショナルノックアウト細胞作成。最近、チェックポイント因子であるTopBP1遺伝子の会合因子として、またゼブラフィッシュのチェックポイント変異体の同定の試みから、Treslin/ticrr遺伝子が新規に同定された（Cell 140:349, 2010; Genes & Dev 24:183, 2010）。この遺伝子は、酵母の複製開始の必須因子で、CDKのリン酸化基質であるSld3と限定的なホモロジーを持つ (Curr Biol 20:R509, 2010)。このTreslin/ticrr遺伝子を、オーキシン誘導性デグロン（AID）の系を用いたコンディショナルノックアウト細胞として作成した。現在その表現型の解析中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

デグロン融合型のGFPの発現は可能であったが、そのレベルは高くなく、細胞周期特異的なGFPの分解がはっきりと検出できていない。そのため、デグロンとしての有用性が評価困難となっている。

Strategy for Future Research Activity

ニワトリDT40細胞において十分な発現が得られないとすれば、現在使用している配列をさらに絞り込んでよく発現させる可能性がある。また、GFPを二つタンデムに結合して、より蛍光強度をあげ、検出感度を高める可能性がある。また、すでにほ乳類細胞でFucciの細胞周期特異的発現は成功しているので、系をほ乳類細胞とし、Fucciで使用されたGeminin とCdt1のデグロン配列を用いて、細胞周期特異的に特定因子発現を行う可能性がある。次年度はこれらの可能性について検討していく。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

上記のように、研究の進行がやや遅れたため、使用されず残った研究費が出た。次年度は、この費用も含めて研究を進展させていく。すべて消耗品として使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] DNA robustly stimulates FANCD2 monoubiquitylation in the complex with FANCI. (2012)
  • Author(s): Sato K, Toda K, Ishiai M, Takata M, Kurumizaka H.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 46 Pages: 4553-61.
  • DOI: 10.1093/nar/gks053.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ATR-Chk1 signaling pathway and homologous recombinational repair protect cells from 5-fluorouracil cytotoxicity. (2012)
  • Author(s): Fujinaka Y, Matsuoka K, Iimori M, Tuul M, Sakasai R, Yoshinaga K, Saeki H, Morita M, Kakeji Y, Gillespie DA, Yamamoto KI, Takata M, Kitao H, Maehara Y.
  • Journal Title: DNA Repair (Amst). Volume: 11 Pages: 247-58
  • DOI: 10.1016/j.dnarep.2011.11.005,
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ATR-ATRIP kinase complex triggers activation of the Fanconi anemia DNA repair pathway. (2012)
  • Author(s): Shigechi T, Tomida J, Sato K, Kobayashi M, Eykelenboom JK, Pessina F, Zhang Y, Uchida E, Ishiai M, Lowndes NF, Yamamoto K, Kurumizaka H, Maehara Y, Takata M.
  • Journal Title: Can Res Volume: 72 Pages: 1149-1156
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-11-2904
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Predisposition to cancer caused by genetic and functional defects of Mammalian atad5 (2011)
  • Author(s): BellDW, Sikdar N, Lee KY, Price JC, Chatterjee R, Park HD, Fox J, Ishiai M, Rudd ML, Pollock LM, Fogoros SK, Mohamed H, Hanigan CL; NISC Comparative Sequencing Program, Zhang S, Cruz P, Renaud G, Hansen NF, Cherukuri PF, Borate B, McManus KJ, Stoepel J, S
  • Journal Title: PLoS Genet Volume: 7(8) Pages: e1002245
  • DOI: DOI:10.1371/journal.pgen.1002245
• [Journal Article] FancJ/Brip1 helicase protects against genomic losses and gains in vertebrate cells. (2011)
  • Author(s): Kitao H, Nanda I, Sugino RP, Kinomura A, Yamazoe M, Arakawa H, Schmid M, Innan H, Hiom K, Takata M.
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: 16 Pages: 714-27
  • DOI: 10.1111/j.1365-2443.2011.01523.x.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The involvement of SLX4 in interstrand cross-link repair is regulated by the Fanconi anemia pathway. (2011)
  • Author(s): Yamamoto KY, Kobayashi S, Kurumizaka H, Takata M, Kono K, Jiricny J, Takeda S, Hirota K.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Volume: 108 Pages: 6492-6.
  • DOI: 10.1073/pnas.1018487108
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] USP1 deubiquitinase maintains phosphorylated CHK1 by limiting its DDB1-dependent degradation. (2011)
  • Author(s): Guervilly JH, Renaud E, Takata M, Rosselli F.
  • Journal Title: Hum Mol Genet Volume: 20 Pages: 2171-81
  • DOI: 10.1093/hmg/ddr103
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The role of SNM1 family nucleases in etoposide-induced apoptosis. (2011)
  • Author(s): Hosono Y, Abe T, Ishiai M, Takata M, Enomoto T, Seki M.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 410 Pages: 568-73
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2011.06.027
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Direct Inhibition of TNF-α Promoter Activity by Fanconi Anemia Protein FANCD2 (2011)
  • Author(s): Matsushita N, Endo Y, Sato K, Kurumizaka H, Yamashita T, Takata M, Yanagi S.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 6 Pages: e23324
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0023324
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Formaldehyde catabolism is essential in cells deficient for the Fanconi anemia DNA-repair pathway. (2011)
  • Author(s): Rosado IV, Langevin F, Crossan GP, Takata M, Patel KJ.
  • Journal Title: Nat Struct Mol Biol. Volume: 18 Pages: 1432-4.
  • DOI: 10.1038/nsmb.2173.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fanconi anemia: a disorder defective in the DNA damage response. (2011)
  • Author(s): Kitao H, Takata M.
  • Journal Title: Int J Hematol. Volume: 93 Pages: 417-24
  • DOI: 10.1007/s12185-011-0777-z
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Guest editorial: fanconi anemia and the DNA damage response. (2011)
  • Author(s): Takata M
  • Journal Title: Int J Hematol. Volume: 93 Pages: 415-6
  • DOI: 10.1007/s12185-011-0832-9
  • Peer Reviewed
• [Presentation] "Fanconi anemia and the DNA damage response" (2012)
  • Author(s): Minoru Takata
  • Organizer: The Sugahara Memorial International Symposium(招待講演)
  • Place of Presentation: 稲盛ホール（京都市）
  • Year and Date: Jan 25-26, 2012
• [Presentation] 「DNA損傷への応答メカニズムと疾患」 (2012)
  • Author(s): 高田穣
  • Organizer: 第11回分子予防環境医学研究会(招待講演)
  • Place of Presentation: 倉敷市市民会館（倉敷市）
  • Year and Date: 2012.1.27
• [Presentation] Fanconi anemia and the DNA damage signaling (2011)
  • Author(s): Minoru Takata
  • Organizer: DNA損傷応答シグナルにおけるクロマチン動態とエピジェネティクス制御, 27th RBC-NIRS International Symposium(招待講演)
  • Place of Presentation: コープイン京都（京都市）
  • Year and Date: Dec 9-10, 2011
• [Presentation] 「放射線被曝医療」司会 (2011)
  • Author(s): 高田穣
  • Organizer: 第28回日本医学会総会 講演会 特別企画プログラム(招待講演)
  • Place of Presentation: 東京ビッグサイト（東京都）
  • Year and Date: 2011.9.17
• [Presentation] International session for DNA repair and related subjects (2011)
  • Author(s): Takata, M
  • Organizer: 日本放射線影響学会第54回大会(招待講演)
  • Place of Presentation: 神戸商工会議所会館（神戸市）
  • Year and Date: 2011.11.19
• [Presentation] "Genome Dynamics: molecular network in maintenance and conversion" organizer (2011)
  • Author(s): 高田 穣
  • Organizer: 日本分子生物学会第34回年会(招待講演)
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（横浜市）
  • Year and Date: 2011 – 1214-16
• [Presentation] Molecular mechanisms of the Fanconi anemia pathway (2011)
  • Author(s): Masamichi Ishiai, Junya Tomida, Tomoko Shigechi, Akiko Itaya, Emi Uchida, Junya Unno, Minoru Takata
  • Organizer: 日本分子生物学会第34回年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（横浜市）
  • Year and Date: 2011 – 1214-16
• [Presentation] ファンコニ貧血コア複合体によるＡＴＲ－ＡＴＲＩＰキナーゼのクロマチン動態制御 (2011)
  • Author(s): 高田穣、冨田純也、板谷（内田）亜希子、茂地智子、海野純也、前原善彦、石合正道
  • Organizer: 第70回日本癌学会学術総会 シンポジウム"Molecular basis of genome instability in cancer"
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（名古屋市）
  • Year and Date: 2011 – 103-5
• [Presentation] An Absolute Requirement of ATRIP-ATR Kinase in Replication Stress-induced Triggering of the FA Pathway Activation (2011)
  • Author(s): T.Shigechi, J.Tomida, K.Sato, Y.Zhang, E.Uchida, J.Eykelenbo, N.Lowndes, H.Kurumizaka, Y.Maehara, M.Takata
  • Organizer: 23rd ANNUAL Fanconi Anemia Research Fund SCIENTIFIC SYMPOSIUM
  • Place of Presentation: Princesa Sofia Hotel（スペイン）
  • Year and Date: 2011 – 1020-23
• [Remarks]
  • URL: http://www.rbc.kyoto-u.ac.jp/Late_Effect/Site_
• [Remarks] １/Welcome.html