2011 Fiscal Year Research-status Report
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23651134
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
佐藤 記一 群馬大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (50321906)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | マイクロ流体デバイス / バイオアッセイ / 血液脳関門 |
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| Research Abstract |
PDMSマイクロチップ内に毛細血管に見立てた微細流路を作製し、ここに血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイト３種類の細胞を配置し、共培養することにより実際の血液脳関門（BBB）を模倣したマイクロBBBを構築することを目指してデバイス開発を行った。チップはスライドガラス上にマイクロ流路を造形したポリジメチルシロキサン（PDMS）シートを貼り合わせて作製した。その際、PDMSシート間に多孔質ポリカーボネート膜を挟み込み、これを細胞培養の支持膜とした。フィブロネクチンやコラーゲンなど細胞外マトリックスをコーティング後、実際にモデル細胞の培養を試みた。開発するマイクロモデルでは最終的には血管モデルとしてヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）を用いる予定だが、この細胞はかなり高価であり、取り扱いが容易でないため、今年度の研究にはヒト由来の株化された上皮細胞を用いた。検討の結果、フォトリソグラフィーで作製する深さ200ミクロン以下の流路ではコンフルエントな培養は難しいことが分かった。そのため、深さ500ミクロン以上の棒を鋳型として用いる方法により、深い流路を構築してこれを培養槽とした。また、細胞支持膜とPDMSの接着が十分ではないことが多かったため、支持膜の端を流路が通過すると液漏れをおこす危険性があったため、膜の端を回避する設計を見いだした。また、コンフルエントな細胞培養を実現するためには、細胞の播種時には通常よりも高密度の細胞懸濁液を用いる必要があった。細胞増殖を促すためには細胞が接着後、極めてゆっくりの速度で培地を連続的に供給しながら培養する必要があることを見いだした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画にあったとおり、膜を挟んだPDMSチップを設計・試作し、膜の素材や表面修飾方法、流路構造や細胞播種方法、細胞培養条件などについて検討してきた。その結果、細胞培養にふさわしいチップ形状や培養方法についての様々な知見を得ることができ、培養の基本的な手順は開発できたと考えられ、本年度目指していた研究の多くは実現できた。しかしながら、これらの実験はすべてヒト由来のモデル細胞株を用いたものであり、実際に微小血管内皮を構築するために必要な細胞を使った実験は実現できなかった。そのため細胞の分化状態の確認などは行うことができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
23年度の研究内容について、引き続き検討をおこないながら、透過性試験を実際におこないながらマイクロBBBの改良をおこなう。 構築したマイクロBBBについて、BBBとして正しい性能を有しているかを確認するために、各細胞特有のマーカータンパク質の発現を調べることにより、分化状態を確認する。必要な分化状態が確認できない場合は培養条件や用いる細胞種を変更することなどを検討する。 脳腫瘍に対する抗がん剤や、精神疾患などに用いられる中枢神経作用薬など脳に働く薬として代表的な物のうち、蛍光性を持つかHPLCなどで分析しやすいものをいくつか選択し、実際に透過性試験をおこない、文献値と比較することによりその性能を評価する。また、比較としてBBB非透過性物質でも同様の試験をおこなう。 実際にバイオアッセイで利用するためには操作が容易であることと、再現性が高いことが必要である。BBBの性能を妨げない範囲で、細胞培養工程を簡略化できるか、試料導入の送液系を簡便化できるかについて検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
研究費は主にマイクロチップの作製に関する消耗品の購入に充ててきており、24年度も引き続き当該消耗品購入に使用予定である。23年度に行った実験はすべてモデル細胞株を用いたものであり、実際に微小血管内皮を構築するために必要な細胞を用いた実験は24年度に行うように計画を変更したため、その変更に伴って24年度に使用する研究費が生じた。24年度は実際にBBBのモデルとしてふさわしい細胞を用いてマイクロモデル構築の最適化とその性質の検討をおこなう予定であるが、用いる細胞の多くは初代細胞であり、細胞及び専用培地が極めて高価であり、この費用について本研究費からまかなう予定である。
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