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2011 Fiscal Year Research-status Report

核酸で構成された人工イオンチャネルの創製

Research Project

Project/Area Number 23657072
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

片平 正人  京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (70211844)

Project Period (FY) 2011-04-28 – 2013-03-31
Keywords核酸 / 生物物理 / イオンチャネル / 4重鎖 / リポソーム / コレステロール
Research Abstract

グアニン塩基に富む配列からなる核酸(DNA及びRNA)は、生理的な濃度のカリウムイオン等の存在下で、4重鎖構造を形成する。この4重鎖構造は、イオンの結合という観点から見ると、タンパク質性のイオンチャネルと類似した分子構造を有している。そこで本研究では、4重鎖構造を形成した核酸を膜に埋め込む事で、核酸で構成された人工のイオンチャネルを創製する事を目指している。 カリウムイオン、カルシウムイオン等をキレートする事で4重鎖構造を形成する事が確認されている3種類の核酸d(GGGGTTTTGGGG)、d(G)20及びr(G)20を調製した。脂質2重膜内部の疎水的な環境への親和性を高めるために、これらの核酸の末端にコレステロールを付加したものも調製した。ここにカリウムイオン等を添加して、4重鎖構造を形成させる。一方リン脂質にコレステロールを少量加えたものを真空引きによってフィルム化し、それを温和な条件で水和する事によって、ジャイアントリポソーム(直径は100 umに達し、これは細胞の大きさに匹敵する)を調製した。さらにリポソーム調製機を用いて均一性を高めた。そして水和の際に4重鎖核酸を共存させる事で、4重鎖核酸をジャイアントリポソームの2重膜に組み込む事を行った。 この際ジャイアントリポソーム内にはカリウムイオンとその蛍光指示薬を封入した。蛍光顕微鏡でジャイアントリポソームの内部を、時間を追って観察したところ、リポソーム内部の蛍光強度の減少が観測された。これより4重鎖核酸がチャネルとして機能して、イオンの流出が生じた事が示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

4重鎖を形成する3種の核酸を調製し(コレステロールを付加したものも調製した)、これをジャイアントリポソームの膜に組み込む事を行った。そしてジャイアントリポソーム内のイオン濃度を蛍光指示薬を用いてモニタリングしたところ、イオン濃度の減少が見出された。即ち4重鎖核酸がイオンチャネルとして機能している事を示唆する結果が得られた。

Strategy for Future Research Activity

平成23年度にジャイアントリポソームを用いて得られた知見を、以下のような別の系を用いて検証・発展させる。通常サイズのリポソームにカリウムイオン及び外液より高いpHの水溶液を封入し、ここにプロトンイオノフォアを添加する。4重鎖核酸がイオンチャネルとして機能すれば、リポソーム内外の濃度の差に起因して、カリウムイオンの流出とプロトンの流入が同時に生じ、リポソーム内のpHは下がるはずである。リポソームに蛍光性pH指示薬(例えばHPTS)も封入しておけば、上記の現象を蛍光強度の変化として、蛍光分光器で検出できるはずであるので、この事を検証する。 2重鎖核酸と1本鎖核酸を組み込んで同様な実験を行い、イオンの流れが4重鎖核酸に特異的に観測されるのか、あるいは核酸一般に見られるのかを検証する。現時点では前者の結果が得られる事を予想している。しかしもし予想に反して後者の結果が得られた場合には、塩基が外向きにフリップアウトし、一方糖-リン酸骨格が中心軸に沿って配置したポーリングモデルがイオンの流れの担い手である可能性も検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

主な用途は以下の通りである。4重鎖を形成する核酸を合成する為のアミダイト等の試薬、培地等の細胞培養用の試薬、成果の学会発表の為の旅費、実験補助者への謝金、学会誌投稿料等。

  • Research Products

    (10 results)

All 2012 2011

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results) Presentation (5 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Intelligent ribozyme that switches its activity in response to K+ through quadruplex formation2012

    • Author(s)
      Takashi Nagata
    • Journal Title

      FEBS J.

      Volume: 279 Pages: 1456-1463

    • DOI

      10.1111/j.1742-4658.2012.08538.x

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Structure of Musashi1 in a complex with target RNA: The role of aromatic stacking interactions2012

    • Author(s)
      Ohyama et al.
    • Journal Title

      Nucleic Acids Res.

      Volume: in press Pages: in press

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Structural aspects for the recognition of ATP by ribonucleopeptide receptorsStructural aspects for the recognition of ATP by ribonucleopeptide receptors2011

    • Author(s)
      Nakano et al.
    • Journal Title

      J. Am. Chem. Soc.

      Volume: 133 Pages: 4567-4579

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Heat shock protein 70 inhibits HIV-1 Vif-mediated ubiquitination and degradation of APOBEC3G2011

    • Author(s)
      Sugiyama et al.
    • Journal Title

      J. Biol. Chem.

      Volume: 286 Pages: 10051-10057

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Sliding-direction-dependent activity of anti-HIV enzyme, and structural basis of anti-prion activity of RNA aptamer2012

    • Author(s)
      Furukawa et al.
    • Organizer
      Korea-Japan Bilateral NMR Symposium(招待講演)
    • Place of Presentation
      北海道大学
    • Year and Date
      2012 – 316
  • [Presentation] Structural basis of the high affinity of the RNA aptamer against prion protein2011

    • Author(s)
      Mashima et al.
    • Organizer
      The 16th annual meeting of the RNA society
    • Place of Presentation
      プリンスホテル(京都府)
    • Year and Date
      2011 – 615
  • [Presentation] Base-deamination rate dependent on the direction of sliding of an enzyme along DNA as revealed by numerical analysis of NMR data, and wood biomass studied by solution NMR2011

    • Author(s)
      Nishimura et al.
    • Organizer
      The International Symposium on Nuclear Magnetic Resonance 2011
    • Place of Presentation
      大桟橋ホール(神奈川県)
    • Year and Date
      2011 – 1117
  • [Presentation] Real-time monitoring of the cytidine deamination along single-stranded DNA by an anti-HIV factor, APOBEC3G2011

    • Author(s)
      Furukawa et al.
    • Organizer
      The International Symposium on Nuclear Magnetic Resonance 2011
    • Place of Presentation
      大桟橋ホール(神奈川県)
    • Year and Date
      2011 – 1116
  • [Presentation] r(GGA)4 chimeric ribozyme switches its activity in response to K+ via quadruplex formation2011

    • Author(s)
      Nagata et al.
    • Organizer
      The 38th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
    • Place of Presentation
      北海道大学
    • Year and Date
      2011 – 1111
  • [Book] 日本化学会編・CSJカレントレビュー"核酸化学のニュートレンド-DNA・RNAの新たな可能性を開く"2011

    • Author(s)
      片平正人
    • Total Pages
      5
    • Publisher
      化学同人

URL: 

Published: 2013-07-10  

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