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2011 Fiscal Year Research-status Report

ケミカルバイオロジーを駆使したマイトファジー制御ツールの確立

Research Project

Project/Area Number 23657090
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

岡本 浩二  大阪大学, 生命機能研究科, 特任准教授 (40455217)

Project Period (FY) 2011-04-28 – 2013-03-31
Keywordsミトコンドリア / オートファジー / 品質管理 / オルガネラ膜動態 / 出芽酵母
Research Abstract

本研究では、細胞の生と死を司る細胞小器官(オルガネラ)であるミトコンドリアの品質管理機構、とりわけオートファジーの仕組みを利用してミトコンドリアを丸ごと分別・除去する機構「マイトファジー」に焦点を絞る。具体的には、出芽酵母をモデルに用いて、マイトファジーを人為的に抑制したり、促進したりするための分子基盤とそれに基づく制御ツールの確立を目指している。 平成23年度においては、ミトコンドリアの分解を定量解析するための適切なプローブについて、改良と詳細な検討を行った。これまでの研究で、大腸菌由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)に蛍光タンパク質mCherryを繋げた融合タンパク質を作製し、酵母細胞のミトコンドリア・マトリックスに局在させたプローブmito-DHFR-mCherryを構築した。このプローブを発現させるための遺伝子カセットを酵母の染色体状に組み込むことで、細胞間でより均一な発現を得ることができる。マイトファジーにより、ミトコンドリアは分解コンパートメントである液胞(リソソームに相当)に運ばれ、分解されるが、mito-DHFR-mCherryのmCherry部分は分解に耐性であるため、遊離のmCherryが蓄積してゆく。この蓄積量をウェスタン解析で定量化することで、マイトファジーをモニタリングできる。mito-DHFR-mCherryの発現量が過剰になると、ミトコンドリアの呼吸や形態に異常を生じることが判明したため、発現プロモーターを各種検討し、アッセイで検出が可能な範囲にて、発現量を低くした。 ミトコンドリア病態モデル細胞の構築については、上記の改良発現システムに基づき、蛍光イメージング解析のための光活性化mito-GFPとmito-mCherry発現細胞株の構築を進めている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成23年度における「研究の目的」の達成度については、当初の予定よりもやや遅れていると評価している。これは、ミトコンドリア分解を定量化するためのアッセイシステムの改良に取り組んだためであり、多少の回り道ではあるが、より良いツールが作製できた点で、プロジェクト全体に対して必要かつ有意義であると考えている。とりわけ、定量化アッセイにおいて、マーカー・タンパク質のレベルが細胞ごとにばらついてしまうプラスミド発現系ではなく、発現カセットを染色体上に挿入する系を用いたことは重要である。 加えて、発現をコントロールするプロモーターの強度も検討した。これは、マーカー・タンパク質の過剰な発現が、ミトコンドリアの生合成に必要なタンパク質の輸送を阻害し、呼吸能の低下や形態異常を引き起こし、マイトファジーにも副作用を及ぼすからである。 以上、2つの改善点をクリアして作製したマイトファジー・プローブは、今後様々な研究で有効なツールとなることが期待される。

Strategy for Future Research Activity

ミトコンドリア病態モデル細胞の構築に関しては、緑または赤のマーカーをもつ1倍体細胞(野生型ミトコンドリアDNAをもつ細胞と変異型ミトコンドリアDNAをもつ細胞)を構築し、それらを接合により細胞融合させ、緑赤2色の2倍体細胞を作成する。この際、2つのポイントがある。一つは、各1倍体細胞由来のミトコンドリア同士が融合しないよう、融合活性を欠損させた細胞株を用いることにする。もう一つは、2倍体細胞における緑赤ミトコンドリア・マーカーのクロス・ターゲティングの問題である。従来の方法では、マーカーの発現を誘導型プロモーターで制御したり、シクロヘキシミドで翻訳を阻害することで対処していた。本研究では、最近開発された光活性型蛍光タンパク質を用いることで、ミトコンドリアを「パルスラベル」する方法を採用する。 ミトコンドリア分解を抑制または促進する低分子化合物のスクリーニングについては、当初の計画通り勧めることとする。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

平成23年度においては、「研究実績の概要」に記述した内容の実験を進めたため、低分子化合物スクリーニングに必要な経費(人件費と消耗品費等)の使用に至らなかった。次年度に請求する研究費と合わせ、スクリーニングを実行するとともに、ミトコンドリア病態モデル細胞の構築についても進めてゆく。 また、申請者の研究室で解析中のマイトファジー変異体の中に、マイトファジー特異的因子Atg32の発現量が低下しているものを見出している。これまでの研究で、Atg32の発現誘導がマイトファジーの活性化に重要であることがわかっており、この変異体が欠損しているタンパク質の活性を調節することで、マイトファジーの効率を人為的に制御できる可能性を考えている。このタンパク質がどのようなメカニズムでAtg32の発現誘導に関与しているかを明らかにしてゆく。具体的には、Atg32との物理的相互作用を免疫共沈降で解析するとともに、細胞内局在を生細胞蛍光イメージングで観察する。

  • Research Products

    (14 results)

All 2012 2011 Other

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (7 results) Remarks (2 results)

  • [Journal Article] ミトコンドリア品質管理研究の最前線2012

    • Author(s)
      岡本浩二
    • Journal Title

      細胞

      Volume: 44 Pages: 199-202

    • URL

      http://hokuryukan-ns.co.jp/magazines/archives/2012/03/20124_1.html

  • [Journal Article] Mitochondria breathe for autophagy2012

    • Author(s)
      Okamoto, K.
    • Journal Title

      EMBO J

      Volume: 30 Pages: 2095-2096

    • DOI

      DOI:10.1038/emboj.2011.149

  • [Journal Article] Mitochondria autophagy in yeast2012

    • Author(s)
      Kanki, T., Klionsky, D.J., Okamoto, K
    • Journal Title

      Antioxid. Redox Signal

      Volume: 14 Pages: 1989-2001

    • DOI

      DOI:10.1089/ars.2010.3762

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Mitochondria and autophagy: critical interplay between the two homeostats2012

    • Author(s)
      Kondo-Okamoto, N., Okamoto, K.
    • Journal Title

      Biochimica et Biophysica Acta

      Volume: 1820 Pages: 595-600

    • DOI

      10.1016/j.bbagen.2011.08.001

  • [Journal Article] Autophagy-related protein 32 acts as autophagic degron and directly initiates mitophagy2012

    • Author(s)
      Kondo-Okamoto, N., et al.
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 287 Pages: 10631-10638

    • DOI

      10.1074/jbc.M111.299917

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] ミトコンドリア分別・除去システムの基本原理2012

    • Author(s)
      岡本 浩二
    • Organizer
      第74回 酵母研究会(招待講演)
    • Place of Presentation
      キリンビール神戸工場、兵庫県
    • Year and Date
      2012年3月6日
  • [Presentation] Molecular mechanism of mitochondria-specific autophagy in yeast2012

    • Author(s)
      Koji Okamoto
    • Organizer
      Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology(招待講演)
    • Place of Presentation
      Fairmont Banff Springs, Banff, Alberta, Canada
    • Year and Date
      2012年3月23日
  • [Presentation] 選択的ミトコンドリア分解の分子機構2011

    • Author(s)
      岡本 浩二
    • Organizer
      第2回 Molecular Cardiovascular Conference II(招待講演)
    • Place of Presentation
      ホテルピアノ、キロロ、北海道
    • Year and Date
      2011年9月3日
  • [Presentation] Mechanism of Atg32-mediated mitophagy in yeast2011

    • Author(s)
      Koji Okamoto
    • Organizer
      第84回 日本生化学会大会(招待講演)
    • Place of Presentation
      京都国際会館、京都府
    • Year and Date
      2011年9月23日
  • [Presentation] Molecular mechanism of mitophagy in yeast2011

    • Author(s)
      Koji Okamoto
    • Organizer
      Mitochondrial Dynamics: from Mechanism to Disease(招待講演)
    • Place of Presentation
      Chia Laguna Resort, Sardinia, Italy
    • Year and Date
      2011年9月13日
  • [Presentation] Molecular mechanisms of mitophagy in yeast2011

    • Author(s)
      Koji Okamoto
    • Organizer
      FASEB Summer Research Conferences(招待講演)
    • Place of Presentation
      Steamboat Springs, CO, USA
    • Year and Date
      2011年7月21日
  • [Presentation] Mechanism of Atg32-mediated mitophagy in yeast2011

    • Author(s)
      Koji Okamoto
    • Organizer
      Parkinson Disease and Mitophagy(招待講演)
    • Place of Presentation
      東京医科歯科大学
    • Year and Date
      2011年6月11日
  • [Remarks]

    • URL

      http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/labs/okamoto/Okamoto_Lab/

  • [Remarks]

    • URL

      http://apprentice.jpn.org/hp/list-okamoto.html

URL: 

Published: 2013-07-10  

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