2011 Fiscal Year Research-status Report
Ｃｒｙトキシンのクリスタル形成機構を利用する画期的なタンパク質生産技術の開発
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23658048
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
早川 徹 岡山大学, 自然科学研究科, 助教 (30313555)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | タンパク質生産 / 発現ベクター / ペプチドタグ / 凝集体形成 / Cryトキシン / Bacillus thuringiensis / 大腸菌 |
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| Research Abstract |
殺蚊トキシンCry4AaのC末端領域には、タンパク質の凝集体形成を促す因子が存在する。本研究ではCry4Aa由来のポリペプチド、4AaCter(Ile696～Pro851)と連結したタンパク質が大腸菌でアルカリ可溶性の凝集体として発現・蓄積することを示し、発現用タグとしての利用を進めている。凝集体形成には4AaCter中に位置する保存配列、Block7(F802～E834)が重要と考えられるものの、その原理に関しては全く明らかでない。 本年度は凝集体形成に関与する機能構造を明らかにするため、Cry4Aa以外に14種類ある130 kDa型Cryトキシン(Cry1, 5, 7, 8, 9, 12, 14, 21, 26, 28, 32, 43, 47, 48)のblock7ポリペプチドをグルタチオン S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させた。GST融合タンパク質は大腸菌で問題なく発現し、菌体内で凝集体の形成が観察された。しかしその効率はCryトキシンの種類によって異なり、Cry4Aaと同様な高い凝集体形成率(95%)を示したBlock7ポリペプチドはCry5Baや32Aa、48Aa由来のものだけで、特にCry47Aaでは10%以下の低い形成率しか観察されなかった。Block7配列に変異を導入して解析した結果から、Block7配列中の疎水性アミノ酸が凝集体形成に重要であると示唆された。しかしBlock7の配列自体は一般的な可溶性タンパク質に特徴的であり、疎水性アミノ酸の量ではなく、その並び(配列)が重要であると示唆された。一般的にBlock7は4AaCterよりもかなり小さなポリペプチド(33アミノ酸)であり、発現用ペプチドタグとして適している。現在、Cry4Aa由来のBlock7ポリペプチドを利用した幾つかの発現用ペプチドタグを試作している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
全体像には未だに不明な部分が多いものの、タンパク質の凝集体形成に必要なアミノ酸配列の特徴が明らかになりつつある。また130kDa型Cryトキシンの中で、凝集体形成率の高いBlock7配列が判明し、発現用タグとしての利用が容易となった。Cry4Aa由来のBlock7ポリペプチドを利用した発現用ペプチドタグについても幾つかの試作品が構築されている。
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| Strategy for Future Research Activity |
発現用ペプチドタグの試作を継続する。Cry4Aa由来のBlock7ポリペプチドとHisタグ、プロテアーゼ(HRV 14-3C)の認識配列(LEVLFQGP)を組み合わせて、発現タンパク質をHisタグ融合タンパク質として、もしくはネイティブな状態で生産する新しいペプチドタグを構築する。またプロテアーゼ(HRV 14-3C)自体をペプチドタグに組み込むことも考える。実際にタンパク質の生産を行い、試作したペプチドタグの有用性を検証する。発現タンパク質には抗原として診断薬市場で需要のあるミオグロビン(心筋梗塞マーカー)やシスタチンC (腎機能マーカー)、フェリチン(腫瘍マーカー)を選択し、大腸菌での発現用にこれらの人工遺伝子を構築した上でペプチドタグ下流に組み込む。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
現在、発現用ペプチドタグの試作を継続して行っている。研究費は構築中の新規ペプチドタグや次年度で使用予定の発現タンパク質(ミオグロビン、シスタチンC、フェリチン)をコードする人工遺伝子の作製、及び発現タンパク質の精製に用いるNi-カラムなどの消耗品等を賄うために使用する。
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