2011 Fiscal Year Research-status Report
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23658075
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
岸野 重信 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (40432348)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
日比 慎 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (30432347)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | CoA |
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| Research Abstract |
微生物を用いた有機酸や脂肪酸の変換には、エネルギー・補因子を要求する反応が数多く存在する。現在グルコース脱水素酵素やギ酸脱水素酵素等を用いたNAD(P)H再生系は構築されているが、それ以外のエネルギー・補因子再生系は構築されていない。そこで本研究では、有機酸や脂肪酸を用いた変換反応に利用されるエネルギー・補因子としてCoAやFADH2、NAD+などの再生系を構築し、有機酸、脂肪酸変換反応の効率化を目的とした。１ FAD・NADH関連平成２３年度では、申請者が見いだしたリノール酸の水和・脱水反応を触媒する水和酵素CLA-HYを用いて検討した。本酵素は、FAD・NADHを要求する酵素である。申請者は、既に本酵素を発現する形質転換大腸菌を作成しているが、形質転換大腸菌を触媒として扱う場合、反応にはFADの添加が必須であり、NADHを添加することにより水和反応が活性化する。本反応にグルコース脱水素酵素とグルコースを添加したところ、水和活性が大幅に上昇すること、添加すべきNADH量が少量でいいことを見いだした。そこで、既にCLA-HY酵素発現形質転換大腸菌を作成しているが、さらにグルコース脱水素酵素を共発現する形質転換大腸菌の作成を試みた。CLA-HYをコードする遺伝子配列を含むベクターと、グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子配列を含むベクターを作成し、これら二つのベクターをトランスホーメーションした形質転換大腸菌の作成に成功した。２ ATP・CoA関連平成２３年度では、CoAやATPが関与しているモデルとなる反応の探索を行った。その結果、ある化合物１が嫌気性微生物により化合物２へと変換し、本反応にCoAエステルが関与していることを明らかにした。平成２３年度では、現在分析手法があまり存在しないCoAエステルの分析法、特に化合物１や化合物２のCoAエステルの分析系構築を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
二つの項目において研究を進めているが、共にモデルとなる反応を取得し、その解析も順調に進んでいる。また、CoAに関する研究では、化合物１をCoAエステル化する反応条件を予備検討で見いだしている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では２項目について研究を進めているが、共にモデルとなる反応は既に取得できているため、これらのモデル反応を基にその解析を行って行く。具体的には、１ FAD・NADH関連について平成２３年度で作成した、水和酵素とグルコース脱水素酵素の各遺伝子を導入したベクターを大腸菌に共に形質転換した株を作成した。そこで、本形質転換株を用いて培養条件等を検討し、各酵素共に発現する条件を確定する。さらに、本形質転換体を用い、産業的にも需要の多い水酸化脂肪酸の生産効率を上げる。さらに、本形質転換体を用いてFADH2などの再生系の構築を目指す。２ ATP・CoA関連について平成２３年度で、CoA再生系のモデルとして使えそうな反応系の取得に成功している。さらに、本反応に関わるCoAエステルを解析する分析系もほぼ完成しつつある。そこで、本モデル反応について、構築した分析系を用いて分析を行う。さらに、本反応に関わる酵素群の同定、各酵素群のN末端配列の解析を行い、本反応関連酵素の形質転換体を作成する。さらに、本モデル反応を用い、作成した形質転換体を用いてCoA再生系の構築を目指す。また、ATP再生系についても、試みる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成２４年度では、主に消耗品等で研究費を使用する。また、本研究を推進するための有用な情報を取得するため、学会に参加する予定である。
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