2011 Fiscal Year Research-status Report
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23658163
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
松山 倫也 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (00183955)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | 春機発動 / Kiss / GnRH / GtH / マサバ / 神経ペプチド |
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| Research Abstract |
1）2種のKiss（Kiss-1, Kiss-2）産生細胞の脳内局在：マサバの2種Kiss遺伝子をクローニングし、アミノ酸配列に基づきそれぞれの特異抗体を作製した。作製した2種のマサバKiss特異抗体を用い、脳内におけるKiss産生細胞の局在を免疫組織化学的に解析した結果、Kiss-1細胞は脳内に広く分布しているのに対し，Kiss-2細胞は視床下部にのみ存在することが明らかとなった。2）春季発動に伴う各種内分泌因子の遺伝子発現量の変動解析：春季発動に伴う雌マサバの脳における2種Kiss mRNA量の発現変化をreal-time PCRを用いて解析した。その結果、KiSS-2発現量は成熟に伴い減少し、産卵期後に最も低くなったが、KiSS-1の発現量は生殖周期を通して一定であることが明らかとなった。以上、1）および2）の結果より、マサバ雌ではKiss-2がBPG-axisの最上流で性成熟を制御していることが示唆された。3）2種生殖腺刺激ホルモン（FSH, LH）の測定系開発：マサバ成魚の脳下垂体（490尾）を採取し、糖タンパク質を抽出後、各種クロマトグラフィー、ゲル濾過に段階的にかけ、純度の高いFSHαβ, LHαおよびLHβを得た。精製物をウサギに免疫し、それぞれのポリクローナル抗体を得た後、ウェスタンブロットを行った結果、得られた抗体はそれぞれの抗原を認識することを確認した。4）Kiss投与による配偶子形成促進効果：配偶子形成前のマサバ雌雄（11月下旬採集）に対して，合成Kiss-1（15アミノ酸）およびKiss-2（12アミノ酸）をオスモティックポンプで徐放投与し，定期採集を行った。その結果、投与45日後で、Kiss-1投与の雄において排精が見られた。一方、雌ではいずれの実験区でも顕著な変化が認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
23年度は５項目の研究を計画したが、以下、それぞれについて達成状況を述べる。 1）2種のKiss（Kiss-1, Kiss-2）産生細胞の脳内局在：作製したマサバKiss-1およびKiss-2の特異抗体を用いて、脳内におけるKiss産生細胞免疫組織化学的に解析し、それぞれの脳内局在を明かにした。ほぼ計画通りに進行し、当初の目標を達成できた。 2）採集したマサバの生殖腺組織切片標本作製およびにKiss受容体（GPR-54）の遺伝子クローニング時間を費やした結果、Kiss mRNA量のみの測定となった。3種GnRH，FSH-β，LH-β，FSH受容体，LH受容体は既に遺伝子クローニング済みである。3）2種GtHの測定系開発： FSHαβ, LHαおよびLHβのポリクローナル抗体を得た。ほぼ予定通りの進行である。 4）マサバへのKiss投与による春季発動促進効果：春機発動前のマサバ個体は養殖業者からの購入を予定していたが、実験をする十分量の材料の入手ができなかった。従って、実験4）に関しては進行していない。 5）マサバへのKiss投与による成熟・産卵誘導効果：配偶子形成前のマサバ雌雄に合成Kiss-1およびKiss-2を投与した結果、Kiss-1投与の雄において排精が見られた。ほぼ計画通りに進行し、当初の目標を達成できた。 以上、実験計画1）、3）、5）に関しては当初の計画通り進んでおり、実験計画2）はやや遅れており、実験計画4）に関しては遅れている、と判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
24年度の計画は以下のとおりである。1）春季発動に伴う各種内分泌因子の遺伝子発現量の変動解析：23年度に測定できなかった、2種Kiss受容体（GPR-54），3種GnRH，FSH-β，LH-β，FSH受容体，LH受容体のmRNA量の発現変化をreal-time PCRを用いて解析する。2）春季発動に伴う各種内分泌因子の分泌動態解析：3種GnRHの脳内および脳下垂体内ペプチド量，血中FSHおよびLH量，血中estrdiol-17βおよび17,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one（17,20β-P）量を測定する。血中FSHおよびLH量の測定法は、24年度中に開発する。3）マサバへのKiss投与による春季発動促進効果：春季発動前のマサバ雌雄（1歳）に対して，各種濃度の合成Kiss-1およびKiss-2を筋肉内投与し，定期採集を行う。脳，脳下垂体，生殖腺を採取し，2種Kiss，Kiss受容体（GPR-54），3種GnRH，FSH-β，LH-β，FSH受容体，LH受容体のmRNA量の発現変化をreal-time PCRを用いて解析するとともに，投与効果を生殖細胞の発達状態で判定する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
研究は全体的に、当初の予定通り進行している。本研究中、最も難しいと予想されるのは、精製GtH（FSHおよびLH）を抗原にして作製したGtH抗体を用いた血中GtH測定系の開発である。23年度はFSHαβ, LHαおよびLHβのポリクローナル抗体を得た。得られた抗血清は、脳下垂体における免疫染色およびウェスタンブロットで、それぞれの抗原を認識することを確認した。しかし、一部交雑が認められ、血中測定用の抗体としては純純度が足りないことがうかがわれた。したがって24年度は、精製したFSHαβ, LHαおよびLHβをマウスに免疫し、それぞれのモノクローナル抗体を作製することを計画している。モノクローナル抗体の完成後、サンドイッチELISA法によるマサバの血中FSHおよびLH測定系の完成を目指す。モノクローナル抗体作製は専門会社に外注する予定で、24年度の研究費の大半はそれに使用する。
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[Presentation] Kisspeptin and GnRH expression profiles in the brain and pituitary of female chub mackerel (Scomber japonicas) during the spawning cycle.2011
Author(s)
Selvaraj S, Kitano H, Amano M, Nyuji M, Ohga H, Yamaguchi A, Yoneda M, Shimizu A, Matsuyama M.
Organizer
9th International Symposium on Reproductive Physiology of Fish
Place of Presentation
Cochin, India
Year and Date
2011, Aug, 12
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[Presentation] Eexpression profiles of GTHsubunit mRNAs during seasonal and spawning cycles in female chub mackerel Scomber japonicus and in vitro steroid potency of purified GTHs in vitellogenic oocytes.2011
Author(s)
Nyuji M, Ohga H, Kitano H, Selvaraj S, Yoneda M, Shimizu A, Yamaguchi A, Matsuyama M.
Organizer
9th International Symposium on Reproductive Physiology of Fish
Place of Presentation
Cochin, India
Year and Date
2011, Aug, 12
