2011 Fiscal Year Annual Research Report
哺乳類のメス生殖細胞におけるpiRNA/PIWIの機能解析を目指した挑戦的研究
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23658221
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
内藤 邦彦 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (20188858)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2012-03-31
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| Keywords | 応用動物 / 畜産学 / 卵成熟 / piRNA / PIWI |
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| Research Abstract |
本研究では、我々の遺伝情報を後代へ伝える生殖細胞のゲノムが、いかにして寄生遺伝子レトロトランスポゾン(TE)の脅威を免れているかという観点から、オス生殖細の維持に必須であるPIWIのTE抑制機能が、卵でも機能している可能性をブタ卵を用いて探った。マウス卵ではPIWIの多くが存在しないが、RNA解析からブタ卵ではPIWIL1とPIWIL2の2種のmRNAが減数分裂過程を通して存在することを確認した。そこでこれらの遺伝子をRT-PCRによりクローニングしRNA合成用のベクターを構築した。
PIWIL1およびPIWIL2のアンチセンスRNAをブタ卵に注入し発現を抑制したところ、卵の減数分裂が正常では起こり得ない早い時間に開始することを見出した。これらの結果から、メスでもPIWIが重要な機能を果たすことを示唆できた。加えてmiRNAや内在性siRNAを介したRNAサイレンシング機構に働くDICERについても遺伝子クローニング、発現抑制を行った結果、PIWIと同様に減数分裂が早期に開始することを明らかとし、これらは互いの機能を補償し合っている可能性も示唆した。以上は減数分裂の開始を促す培養系を用いた実験結果であるが、生体内で減数分裂を停止している状態をin vitroで再現する培養系を用いたところ、PIWIやDICERの抑制で減数分裂が開始してしまうことが示された。このことはTEの抑制が生理的に哺乳類卵の卵巣内での減数分裂停止に寄与していることを示唆しており興味深い。減数分裂の開始は成熟/M期促進因子(MPF)の活性に依存するためMPFサブユニット、さらにMPFの制御因子の変動を調べたところ、MPF制御サブユニットであるCyclin Bの蓄積が早まることを見出し、これが減数分裂の早期開始や停止解除の原因であると考えられた。PIWIやDICERの抑制によりCyclin Bの蓄積が早まる機構を解明すべくPIWIやDICER抑制時のCyclin B RNA量の変化、Cyclin Bの翻訳に働くAurora A、CPEBの変化を調べたが、これらには変化は見られなかった。したがってCyclin Bの分解が抑制されている可能性があるが、本実験では検討できなかったので、今後はCyclin Bの分解に関与するAPCなどに注目して研究を進める必要がある。またPIWIやDICERの抑制が実際にTE量に変化をもたらしているかをブタのHNE1とLTRトランスポゾンについて半定量RT-PCRで調べたが、今回調べた限りにおいてはTE量に変化は見られなかった。したがってSINEなど今回調べた以外のTEについて検討する必要がある。あるいはTE抑制以外の機構を介している可能性も考えられる。
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Research Products
(1 results)
