2011 Fiscal Year Research-status Report
次世代医療用糖タンパク質の生産を目指したカイコからヒト型糖鎖創出技術の開拓
| Project/Area Number |
23658286
|
|---|
| Research Institution | Shizuoka University |
|---|
Principal Investigator |
朴 龍洙 静岡大学, 創造科学技術大学院, 教授 (90238246)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
|
| Keywords | バイオテクノロジー / 糖鎖 / タンパク質 / 昆虫 / 遺伝子 |
|---|
| Research Abstract |
カイコのパウチマンノース型糖鎖合成は、GlcNAcMan3GlcNAc2からα1,6-fucosyltransferase（α6FucT）によるフコースの付加経路が考えられる。しかし昆虫細胞では数種類のN-acetylglucosaminidase（GlcNAse）による影響が予測され、GlcNAseの干渉を1年目行うような計画変更を行った。siRNAの配列選択にはsiRNA Target Finderを利用し、PCRで増幅、siRNAカセットを作製し、大腸菌DH5αに形質転換を行った後、Bac to BacシステムによりBｍNPVバクミドを完成した。バクミドDNAを用いてカイコに注射し、5日間飼育後カイコ脂肪体を回収し、GlcNAseの活性を測定した。その結果、カイコにおいてはRNAi導入しなかった場合に比べ殆ど活性の差がなかった。これは数種類のGlcNAseの存在でお互いに活性を補っていることを示唆する。そこで、GlcNAseIとIIを昆虫細胞で干渉を行ったところ、それぞれ20％程度化成の低下が確認できた。この結果は,今後GlcNAseのダブル干渉を行う必要があることを示唆する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初、GlcNAcMan3GlcNAc2からα1,6-fucosyltransferase（α6FucT）によるフコースの付加経路が考えられるα3FucT干渉を計画したが、数種類のN-acetylglucosaminidase（GlcNAse）による影響が予測され、GlcNAseの干渉を1年目行うような計画変更を行ったことで、研究が少々遅れた。しかし、次年度からは構築したRNAiシステムを使用できるので、計画通りに進展できると考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
カイコでバイセクティングN-GlcNAc構造を持つ糖鎖の合成系を確立するために、N-acetylglucosaminidase（GlcNAse）IとIIのダブル干渉を行う。１）GlcNAcβ1-4Man β1-4結合を触媒するβ1,4N-acetylglucosaminyltransfersae（β4GnT III）をカイコに導入し、バイセクティングN-GlcNAcMan3GlcNAc2の合成系を強化する。２）二つの遺伝子及びhβ3GnTバクミドを共発現の方法でカイコに導入し、hβ3GnTの発現を行い、酵素活性、hβ3GnTの精製、及び糖鎖を解析し、糖鎖のパターンを調べる。hβ3GnTの発現には、ポリへドリンプロモーターを用いるが、β2GnT Iやβ4GnT IIIについては、恒常的に発現するアクチンプロモーターを用いる
|
| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
50万以上の機器の購入は必要なく、研究に必要な消耗品を計画的に執行する予定である。
|
