2011 Fiscal Year Annual Research Report
ラパマイシンで惹起されない新しいオートファジー機構を用いた新規薬剤スクリーニング
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23659036
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
小堤 保則 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (70205425)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山銅 ゆかり 京都大学, 生命科学研究科, 教務職員 (70359785)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2012-03-31
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| Keywords | オートファジー / ラパマイシン / 酵母 / Ypk1 / スクリーニング / セリン・スレオニンキナーゼ |
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| Research Abstract |
申請者らは、窒素源飢餓によるオートファジー誘導系に、ラパマイシンで惹起される経路の他に、惹起されない経路があることを見いだしたさらに、後者の経路もラパマイシン惹起され経路と同程度に飢餓応答に必要な経路であることを明らかにした。ラパマイシンが免疫抑制剤、抗ガン剤さらには寿命を延ばす薬剤としても注目を集めていることから、本研究では、後者のオートファジーを惹起する物質も同様に有用なものであると考え、この物質を、新しいオートファジー機構を利用してスクリーニングする系の開発を行うために、以下の2点について研究した。
(1)薬剤スクリーニング系の確立を目指した研究
ラパマイシンで模倣できない新しいオートファジー経路で分解されるタンパク質として酵母の細胞質にあるYpk1に注目し、蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現させ顕微鏡で観察できる系を確立した。主要な液胞(哺乳動物のリソソーム)のタンパク分解酵素を欠損させた細胞を使うことにより、薬剤添加時に、このオートファジー経路が活性化されれば、融合タンパク質が細胞質から液胞に運ばれるため、脂肪質の蛍光強度が減少し、液胞の蛍光強度がすることが判定できる。また、適当なYpk1の断片を使うことにより、より一層観察しやすい系を確立した。また、簡便な系としては野生株を用いてSDS-PAGE後に、western blotを行い、分解の有無で判断するシステムを確立した。
(2)セリン/スレオニンキナーゼ欠損のスクリーニング
ラパマイシンで惹起されない経路に於ける、Ypk1の上流のキナーゼがTOPC1と同様、セリン/スレオニンキナーゼであると仮定して、セリン/スレオニンキナーゼ欠損株のスクリーニングを行った。その結果、ある種のセリン/スレオニンキナーゼがin vivoあるいはin vitroにおいてもYpk1をリン酸化することを見出した。
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