2011 Fiscal Year Research-status Report
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23659111
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
藤原 祐一郎 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20532980)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / レドックス |
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| Research Abstract |
（全体構想）：本研究は、免疫系やストレス応答、脳神経機能において重要な働きを持つ酸化還元状態を可視化し、酸化還元シグナルが種々の臓器・細胞において果たす役割を解明します。（具体的目的）：細胞内の酸化還元の状態を測定するためのFRETベースの蛍光分子プローブを高解像度結晶構造が解けたイオンチャネルの細胞内コイルドコイルドメインを基にデザインします。開発した酸化還元蛍光分子プローブを活動する生きた細胞、具体的には貪食細胞やミクログリアに発現させ、種々の活動ステージにおける酸化還元の状態や、病的に酸化ストレスにさらされた時の細胞内レドックス応答をリアルタイムに非侵襲的に測定します。（平成２３年度）活動する細胞の酸化還元状態をリアルタイムに測定することを目的に、細胞への遺伝子導入する形で使用する酸化還元分子プローブを作成する。（１）「FRETベースのタンパク質性酸化還元プローブのデザイン」申請者が構造を明らかにしたH+チャネル細胞内ドメイン2量体コイルドコイルの一方にドナーとなるCFP、もう片方にアクセプターとなるYFPをつなげたコンストラクトを作成する。第一段階としてタンパク質として発現・精製し、蛍光分光光度計を用いてキュベット内での熱・酸化還元に対する応答を、CFP励起によるYFPの蛍光(Fluorescence Resonance Energy Transfer(FRET))シグナルを測定することにより解析することを試みた。（２）「分子プローブの改良」種々の熱閾値・酸化還元定数を有するバライティーに富んだプローブを作成することが目的である。大腸菌発現システムを用いてコイルドコイル蛋白を発現させ、FPLCクロマトグラフィーで高純度に精製し、酸化還元定数・熱安定性を測定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の目的通りに、細胞内の酸化還元の状態を測定するためのFRETベースの蛍光分子プローブを高解像度結晶構造が解けたイオンチャネルの細胞内コイルドコイルドメインを基にデザインした。種々の熱閾値・酸化還元定数を有するバライティーに富んだプローブに改良した。それ以外に、イオンチャネルの温度依存的に会合・解離する細胞内コイルドコイルドメインがチャネル活性の温度域値を決定している事を見いだし、発表した(Nature communications, in press)。このように、計画以上の進展があった。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成24年度は、作成した酸化還元分子プローブを実際の活動する細胞に適用する目的で実験を行う。（３）「分子プローブを細胞に適用する」開発したタンパク質性酸化還元プローブを細胞に適用することを目的として、手始めに培養細胞(HEK cell line)に分子プローブの遺伝子をトランスフェクションして発現させ温度を上昇・下降させながら細胞内酸化還元状態を蛍光顕微鏡下にFRETシグナルを観測することで測定する。H2O2による酸化ストレス状態や虚血による酸欠状態を再現し測定を行う。（４）「貪食細胞における酸化還元状態のモニター」マウスから採取した好中球・マクロファージに蛍光分子プローブをトランスフェクションし発現させFRETシグナルの測定を行う。測定のゴールは貪食細胞の遊走・浸潤・貪食・ケモカインといった種々のステージでの酸化還元状況をリアルタイムにモニターすることである。（５）「ミクログリアにおける酸化還元状態のモニター」酸化ストレスに応答した脳内ミクログリアの神経保護活動のメカニズムの一端を解明する目的で行う。作成した蛍光分子プローブをミクログリアに遺伝子導入し発現させ、顕微鏡下で休止期から活動期に変わるミクログリアの酸化還元状態をモニターする。H2O2による酸化ストレスを与えた時、あるいは脳虚血による酸欠状態の細胞内酸化還元状態の変化を観察する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
試薬ガラス機器類などの備品消耗品費に900,000円。成果報告のための国内旅費に100,000円、外国旅費に300,000円。実験補助員（短期）雇用のための謝金等に417,673円。その他、印刷出版費用に700,000円を充てる。
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