正常と腫瘍性の子宮平滑筋幹細胞の単離と両者の比較解析：新規治療法の開発に向けて

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23659776
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 佐野 健司 信州大学, 医学部附属病院, 講師 (50205994)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林 琢磨 信州大学, 医学部, 准教授 (60359726)
• Keywords: Cancer stem cell / Side population / Main population / Leiomyosarcoma / Leiomyoma

Research Abstract

手術的に採取されたヒト子宮正常平滑筋組織、または子宮平滑筋腫さらに子宮平滑筋肉腫から組織片を分離して、物理的(鋏でできる 限り細かく切り刻む）、酵素的（コラーゲナーゼtype IV 0.2%とDNase I 0.05%)に消化分離後、平滑筋細胞の培養を試みた。10%FBS+D MEMで10日から2週間培養後にはαSMA陽性かつcalponin陽性の純度の高い平滑筋細胞が得られた。この細胞をレゼルピン、あるいはベラパミル存在化のヘキスト染色で、SP, MPの分離を試みたところ、幹細胞が多く含まれるとされるSP分画が得られた。SPに対するMPのsurvivin1の発現は著増しており、MPはG2/M期を支持しているものと考えられた。初期培養を省略して、平滑筋組織を同様な方法で物理的、酵素的に分離して、単細胞化した直後に、SP, MPの分離も可能であった。しかしながら、両方法ともに分取後の間葉系細胞stem cell用培養試薬では低酸素状態で充分な増殖が得られなかった。同じ材料を使用して、間葉系幹細胞のマーカーとされるCD271の発現も併せて検討した。FACS解析では、数パーセントの割合でCD271陽性細胞が含まれていたが、SP分画と必ずしも一致したものではなく、CD271がstem cellの主分画とは考え難かった。次にSP分画及びMP分画の細胞(1x10の5乗～2x10の5乗個)をNOD-SCIDマウス1匹ずつの副乳頭に移植したが、明かなマウスへの腫瘍生着を確認出来なかった。次年度の課題として、幹細胞の増殖がより早く進むように、SPの細胞量を増やすため、最初の組織量をできるだけ増量して、実験を試みるようにしたい。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

人体材料を扱うため、手術日程との調整や採取量の制約があり、実験回数が限定され、条件検討のための充分量の検体が得られていない。子宮平滑筋肉腫については、少ない頻度のため、一度実験に使用したのみである。 ある程度の培養条件の検討が終了したので、今後、採取量が充分確保可能な平滑筋腫材料で、最終的な至適条件を決定して、平滑筋幹細胞の増殖、遺伝子精製を行っていく。

Strategy for Future Research Activity

（今後の推進方策）
1)検体量が充分に確保可能な平滑筋腫材料を使用して、ヘキスト染色によるSP, MPの分離、 2)分取後、一定の増殖をさせた後、間葉系多分化能の検定を行う。 3)培養条件が安定的に設定できた後に、増殖させた平滑筋腫、正常平滑筋、平滑筋肉腫の幹細胞の遺伝子を精製する。 4)マイクロアレイ解析を行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

平成25年度は、正常子宮平滑筋、子宮平滑筋腫、子宮平滑筋肉腫の3種類の材料により比較発現解析を行う予定であったが、稀少臨床検体の関係で充分量の子宮平滑筋肉腫材料が採取できず、比較発現解析ができない状況となり、未使用分が発生した。
できる限り同一症例で、正常子宮平滑筋、子宮平滑筋腫、子宮平滑筋肉腫の3種類の材料からのSP, MP分画を採取した上で、total RNAを精製し、mRNAの発現解析を行う。未使用額はそのための、培養やRNA抽出、マイクロアレイ解析の経費に充てることとしたい。実験計画の手順として、1) 正常子宮平滑筋、子宮平滑筋腫、子宮平滑筋肉腫の3種類の材料からのSP, MP分画を採取する。2) それぞれの分画の細胞を培養により増殖させる。3) それぞれの分画の細胞のmRNAの抽出する。4) マイクロアレイ解析を行う。

Research Products

• [Journal Article] Proteasome Subunit LMP2/ β1i As a Biomarker for Human Uterine Mesenchymal Tumors. (2013)
  • Author(s): Hayashi T, Horiuchi A, Sano K, Gur G, Aburatani H, Ishiko O, Yaegashi N, Shiozawa T, Kanai Y, Zharhary D, Tonegawa S, Konishi I.
  • Journal Title: J Oncobiomarkers Volume: 1 Pages: 1-6
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Differential expression of LMP2/β1i: as a potential biomarkeral of human uterine mesenchymal tumors. (2013)
  • Author(s): Hayashi T, Horiuchi A, Sano K, Gur G, Aburatani H, Ishiko O, Yaegashi N, Kanai Y, Zharhary D, Tonegawa S, Konishi I.
  • Journal Title: J Interdisciplinary Histopathology Volume: 1 Pages: 153-159
  • DOI: 10.5455/jihp.20130210114005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tumor escape of uterine leiomyosarcoma from immune surveillance in the female genital system. (2013)
  • Author(s): Hayashi T, Horiuchi A, Sano K, Hiraoka N, Ichimura T, Ishiko O, Kanai Y, Yaegashi N, Aburatani H, Shiozawa T, Tonegawa S, Konishi I.
  • Journal Title: Current Res. Immunol. Volume: 7 Pages: 13-25
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The proteasome subunit LMP2/β1i in the female genital system. (2013)
  • Author(s): Hayashi T, Horiuchi A, Sano K, Gur G, Aburatani H, Ichimura T, Yaegashi N, Kanai Y, Zharhary D, Tonegawa S, Konishi I.
  • Journal Title: Journal Gynecology Obstetrics Volume: 1 Pages: 1-6
  • DOI: 10.11648/j.jgo.20130101.11
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Association of proteasome subunit LMP2/β1i with the development of human uterine mesenchymal tumors. (2013)
  • Author(s): Hayashi T, Horiuchi A, Sano K, Hiraoka N, Ichimura T, Ishiko O, Kanai Y, Yaegashi N, Aburatani H, Shiozawa T, Tonegawa S, Konishi I.
  • Journal Title: Current Res. Cancer. Volume: 2 Pages: 1-6
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 隆起性皮膚線維肉腫の遺伝子診断の有用性について (2014)
  • Author(s): 佐野健司、高橋千明、立石文子、神宮俊彦、大月 聡、浅香志穂、上原 剛、吉澤明彦
  • Organizer: 第103回日本病理学会総会
  • Place of Presentation: 広島
  • Year and Date: 20140424-20140426