アカントアメーバの角膜への感染機序の解明

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23659812
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 坂根 由梨 愛媛大学, 医学系研究科, 寄附講座助教 (00601478)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大橋 裕一 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00116005)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2013-03-31
• Keywords: アカントアメーバ / 角膜上皮 / MBP1 / MALDI-TOF/MS / 蛍光標識

Research Abstract

角膜上皮への接着糖蛋白と考えられているアカントアメーバのMannose Binding Protein1(MBP1)が結合する角膜の糖蛋白を同定するため、MBP1細胞外N-domainとC-domainのGST結合蛋白の精製無細胞蛋白合成のコンストラクトpEU-E01-MBPNC-TEV-GST (NC), pEU-E01-MBPN-TEV-GST (N)及びpEU-E01-MBPC-TEV-GST (C)を作成した。SV40T antigen不死化ヒト角膜上皮細胞から細胞膜分画抽出キットで細胞膜分画を分離し、３つのコンストラクトから得られたMBPNC-GST、MBPN-GST、MBPC-GSTと反応させたのちSDS-PAGEで展開し、MBPNC-GST、MBPN-GSTのみに存在するバンドをMALDI-TOF/MSで解析した。KRT1 Keratin, type II cytoskeletal 1、 KRT9 Keratin, type I cytoskeletal 9、 KRT10 Keratin, type I cytoskeletal 1、 Keratin-8-like protein 1、 ACTB 14 kDa protein ACTG1 cDNA FLJ57283, highly similar to Actin, cytoplasmic 2 、HRNR HornerinがMBP1のN-domainと接着していることが解った。蛍光標識アカントアメーバの作成では、CAG,CMV,pgkなどの真核生物で働くプロモーターは働かないことを確認した。そこでアカントアメーバのユビキチンのプロモーターと考えられる1.7kbの領域を人工遺伝子合成してtdTomatoの発色を検討したところ、数日間細胞質に蛍光を観察することができた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

MALDI-TOF/MS解析で得られた蛋白は細胞膜の裏打ち蛋白であり、目的の物質ではない可能性が高い。アメーバは真核生物で使用できるプロモーターやIRESなどの配列が機能していないらしく、コンストラクトの作成に時間がかかった。

Strategy for Future Research Activity

角膜上皮への接着糖蛋白と考えられているアカントアメーバのMannose Binding Protein1(MBP1)が結合する角膜の糖蛋白を同定するためには、ヒトの細胞膜蛋白分画をより細かく、分離する必要があり、糖鎖カラムの使用を検討する。蛍光標識はgenomic DNAへの蛍光蛋白発現の配列を目標とする。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

ヒトの細胞膜蛋白分画を分離する必糖鎖カラムとしてConAカラムの使用する。遺伝子組換えアメーバの作成のため、positive selectionのmarkerとして、neomycinを使用する。