2012 Fiscal Year Annual Research Report
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23659812
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
坂根 由梨 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 寄附講座助教 (00601478)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大橋 裕一 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00116005)
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| Keywords | アカントアメーバ / 角膜上皮 / MBP1 / 蛍光標識 / MALDI-TOF/MS |
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| Research Abstract |
近年、頻回交換型の使い捨てソフトコンタクトレンズとマルチパーパスソリューションを使用しているユーザーに感染性角膜炎が急増している。アカントアメーバ角膜炎は極めて難治であり、治療時期を逸すれば数ヶ月の入院治療が必要となり、最終的に治療的角膜移植を余儀なくされるケースもある。治癒後も視機能障害を残すことは少なくなく、コンタクトレンズ使用者が主として若年層である点において大きな社会問題となっている。角膜上皮への接着糖蛋白と考えられているアカントアメーバのMannose Binding Protein1(MBP1)が結合する角膜の糖蛋白を同定するため、MBP1細胞外N-domainとC-domainのGST結合蛋白の精製無細胞蛋白合成のコンストラクトpEU-E01-MBPNC-TEV-GST (NC), pEU-E01-MBPN-TEV-GST (N)及びpEU-E01-MBPC-TEV-GST (C)を作成した。SV40T antigen不死化ヒト角膜上皮細胞から細胞膜分画抽出キットで細胞膜分画を分離し、３つのコンストラクトから得られたMBPNC-GST、MBPN-GST、MBPC-GSTと反応させたのちSDS-PAGEで展開し、MBPNC-GST、MBPN-GSTのみに存在するバンドをMALDI-TOF/MSで解析した。KRT1、 KRT9、 KRT10、 Keratin-8-like protein 1、 ACTB , HornerinがMBP1のN-domainと接着していることが解った。蛍光標識アカントアメーバの作成では、CAG,CMV,pgkなどの真核生物で働くプロモーターは働かないことを確認した。そこでアカントアメーバのユビキチンのプロモーターと考えられる1.7kbの領域を人工遺伝子合成してtdTomatoの発色を検討し、数日間細胞質に蛍光を観察することができた。
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