2012 Fiscal Year Annual Research Report
細胞凝集塊形成による線維芽細胞からの遺伝子操作を加えない幹細胞の作成
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23659836
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
貴志 和生 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (40224919)
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| Keywords | 再生医療 / 毛包 |
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| Research Abstract |
C57bl/6Jマウス成獣皮膚組織から線維芽細胞を、10％ＦＢＳ添加DMEM培地を用いて、増殖させ、15－20継代培養を行った後に、細胞を回収し超親水性培養皿上で培養した。培地はSkpsの培養と同様の、bFGF(40ng/ml),EGF(20ng/ml)を添加したHamF-12無血清培地に変更した。非接着性培養皿で培養を開始し、経時的に細胞凝集塊を形成した培養細胞と、同じく2次元培養で培地のみ無血清培地に交換をしたものからRNAを抽出し、cDNAに変換した後にreal time PCRにより、未分化幹細胞で発現しているとされる遺伝子発現につき、コンフォーカルマイクロスコープを用いて細胞内の局在を検討した。
その後、マイクロアレイを用いて、発現遺伝子の変化につき網羅的な解析を行った。
培養開始後、様々な時間の後に神経、脂肪、骨、軟骨、平滑筋への分化誘導の可否を検討した。最も未分化な状態に変化した培養条件を用いて、GFPマウス由来線維芽細胞を用いて検討を行った。成獣オスC57blマウスの背部真皮内に培養を行った細胞凝集塊をインスリン針を用いて移植を行った。移植後すぐに、移植部にメス11番を用いて皮膚全
層切開創を作成した。創作成後経時的に皮膚を回収し、創傷治癒における移植細胞の影響を、顕微鏡下に用いて検討を行った。また、同じサンプルを用いて、keratin 5, α-smooth muscle actin, vimentinの免疫染2重染色を行い、移植細胞がどのような細胞に変化したかを検討した。
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