2012 Fiscal Year Annual Research Report
蛍光リガンド結合タンパク質の発現による分泌顆粒の形成・成熟・開口放出過程の可視化
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23659875
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
吉垣 純子 日本大学, 歯学部, 教授 (40256904)
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| Keywords | 唾液腺 / 分泌顆粒 / 調節性分泌 / 輸送シグナル |
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| Research Abstract |
分泌顆粒の形成から開口放出までのライブイメージングを目指して，蛍光リガンド結合タンパク質であるHaloTagを耳下腺腺房細胞の初代培養細胞に発現させる系を立ち上げた。耳下腺の分泌タンパク質であるアミラーゼ遺伝子の部分配列とHaloTagとの融合遺伝子を作成し，アデノウイルスベクターに組み込んで，腺房細胞に導入した。その結果，HaloTagは細胞に効率よく発現し，HaloTagリガンドであるTMR蛍光試薬によりラベルされ，生細胞での観察が可能になった。作成した融合遺伝子のうち，アミラーゼのシグナル配列のみを結合したHaloTagが，アミラーゼと細胞内局在が一致していた。また，βアドレナリン受容体アゴニストであるイソプロテレノール依存的に分泌されたことから，HaloTagタンパク質が分泌顆粒へ輸送されたことが確認できた。共焦点レーザー顕微鏡に設置した培地灌流装置を利用して，観察しながらβアドレナリン受容体刺激を行ったところ，顆粒状蛍光の消失がリアルタイムに観察され，刺激依存的な開口放出のライブイメージングに成功した。 これまで，唾液腺において分泌タンパク質の輸送経路がどのように制御されているかは不明であった。何らかの輸送シグナルの存在や，分泌タンパク質の複合体形成が顆粒への輸送に必須であるという意見がある。しかし今回の結果から，分泌顆粒への輸送には特別なシグナルは必要なく，小胞体において膜を超えるためのシグナルペプチド配列があれば，分泌顆粒へ受動的に輸送されることがわかった。また，Native PAGEにより分泌顆粒内のタンパク質の複合体形成を調べたところ，アミラーゼが多量体を形成しているのに対して，HaloTagは単量体で存在していることが確認できた。本研究により，唾液腺における分泌タンパク質の顆粒への輸送には，特別な輸送シグナルも，複合体形成も必要でないことが示唆された。
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