2013 Fiscal Year Annual Research Report
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23685038
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| Research Institution | Nagaoka University of Technology |
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Principal Investigator |
築地 真也 長岡技術科学大学, 産学融合トップランナー養成センター, 特任准教授 (40359659)
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| Project Period (FY) |
2011-11-18 – 2014-03-31
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| Keywords | 化学修飾 / アフィニティラベル化 / 蛋白質 / リガンド / トシル化学 |
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| Research Abstract |
本研究では、申請者が開発した「リガンド指向型トシル（LDT）化学」を発展させ、細胞内の望みの部位に望みの機能性プローブや翻訳後修飾を高速・高効率に導入可能な汎用性の高い細胞内蛋白質ラベル化基盤を確立することを目的としている。
当該年度は、LDT化学と遺伝子工学を融合したアプローチに取り組み、対象蛋白質のリガンド結合ポケット周辺に高求核性アミノ酸Cysを変異導入したものに対するLDT化学を検討した。FKBP12を対象モデル蛋白質として採用し、リガンド結合ポケットのすぐ近くおよび少し離れた部位にCysを導入（single mutation）した変異体を30種類ほど作成した。それらのFKBP12変異体と蛍光ラベル化剤シリーズ（C5スペーサー）をさまざまな組み合わせで反応させ、in vitroでのラベル化効率をSDS-PAGE／in-gel蛍光検出により系統的に評価した。一連のスクリーニング実験の結果、リガンド結合ポケットのすぐ近傍にあるThr86をCysに置換した変異体は天然型FKBP12よりもおよそ2倍の反応初速度とラベル化収率を示すことが明らかとなった。現在、次なるステップとして、このFKBP12(T86C)の細胞内ラベリング効率について評価を進めている。
また上記の実験と並行して、細胞内在性FKBP12の蛍光ラベリングとlive-cellイメージングにも取り組んだ。天然型FKBP12に最適化したラベル化剤（ピペラジンスペーサー）を用いることで、細胞内在性FKBP12に緑色蛍光色素OregonGreenを高選択的に標識することに成功した。また、このOregonGreenラベル化FKBP12はラパマイシンの存在下でFRBと赤色蛍光蛋白質の融合蛋白質とヘテロ二量化し、その生細胞内での複合体形成をFRETイメージングにより可視化することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Reason
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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