• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2012 Fiscal Year Research-status Report

コモンマーモセット受精卵へのアデノ随伴ウイルスベクターによる遺伝子導入法の開発

Research Project

Project/Area Number 23700521
Research Institution独立行政法人国立精神・神経医療研究センター

Principal Investigator

岡田 浩典  独立行政法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所 遺伝子疾患治療研究部, 科研費研究員 (80416271)

Keywordsアデノ随伴ウイルスベクタ ー / コモンマーモセット / 受精卵 / 遺伝子挿入 / 疾患モデル動物
Research Abstract

本研究ではアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いてコモンマーモセットの受精卵ゲノム上のAdeno-associated virus integration site 1(AAVS1)領域に限定された効率的な遺伝子導入方法を開発する。そのためは ①コモンマーモセットのAAVS1 領域の同定 ②AAVS1領域へ目的遺伝子を挿入するためのAAV ベクターの構築 ③AAV ベクターのコモンマーモセット受精卵への感染条件の検索が必要である。当該年度はその中でAAVベクターの構築およびその機能確認について重点的に実施した。昨年度に構築した、2型AAVのRepタンパク質を発現する5型AAVベクタープラスミドを用いてAAVベクター(rAAV5-hA2R68)を作製した。同時に、本AAVベクターの機能評価を目的として、CMVプロモーター下にGFPおよびblasticidin耐性遺伝子を発現する2型AAVベクタープラスミドを用いて1型AAVカプシドにシュードタイプ化したAAVベクター(rAAV1-CEIB)、およびコモンマーモセットの腎臓に由来する初代培養細胞にSV40 Large T抗原を導入して不死化細胞(CJKT細胞)を作製した。CJKT細胞にrAAV5-hA2R68およびrAAV1-CEIBを共感染させたところ、およそ0.1%の割合でGFP発現を発現し、かつblasticidinに耐性のコロニーが得られたため、これらの細胞のクローン化を実施中である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では経済的・倫理的に多数の検討を行う事が難しい霊長類においても確実に効率良くゲノム上の安全な領域に限定して目的とする遺伝子を挿入するために、AAV ベクターを用いたコモンマーモセット受精卵への遺伝子導入方法の開発を行っている。本法は野生型アデノ随伴ウイルス(AAV)が持つRepタンパク質を作用させ、Repを欠損するAAVベクターゲノムを、対象であるコモンマーモセットのゲノムに挿入させる。当該年度はコモンマーモセットのAAVS1領域に特異的にベクターゲノムを挿入するために必要なAAVベクターを作製した。本AAVベクターのおおよその特性を把握するにあたり、コモンマーモセット由来不死化細胞株のAAVS1領域に対するAAVベクターゲノムの挿入を試みた。通常よりも遥かに高い確立で導入遺伝子を安定に発現するコロニーが得られており、能動的なAAVベクターゲノムの挿入が起きていると予想される。今後、実際のAAVベクターゲノムの挿入様式の解析を行うとともに、挿入効率を改善する事で、今後受精卵への応用が期待出来る。

Strategy for Future Research Activity

本研究ではAAV ベクターを用いたコモンマーモセット受精卵への遺伝子導入方法の開発を行っている。本法は野生型アデノ随伴ウイルス(AAV)が持つRepタンパク質を作用させ、Repを欠損するAAVベクターゲノムを、対象であるコモンマーモセットのゲノムに挿入させる。現在までに、マーモセットにおいてもAAVS1領域がよく保存されていることを確認している。また、Repタンパク質を補助的に発現させるためのAAVベクターおよび挿入されるAAVベクターを作製している。これらのAAVベクターを実際にコモンマーモセットの不死化細胞に導入し、ホストゲノム上のAAVS1 領域へのAAVベクターゲノムの挿入について検討を開始しており、今後はその挿入様式にして検証を進める。また、実際にAAV ベクターを用いてコモンマーモセット受精卵に適した感染条件を検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

Repタンパク質を補助的に発現させるためのAAVベクターの機能確認を進めているが、今後培養条件に敏感な受精卵に応用するにあたり、高力価かつ高純度なものを作製しなければならない。そのためには構築したベクタープラスミドを大量に調製する必要がある。このために培養液、抗生物質、精製キットを購入する。このベクタープラスミドをヒト由来不死化細胞に導入し、大量のAAVベクターを産生させる。このためにプラスミドの導入試薬、細胞培養液、抗生物質、培養容器等がを購入する。産生されたAAVベクターを高力価かつ高純度に精製しなければならない。そのため、精製に必要な試薬類、強イオン交換膜、遠心チューブ等を購入する。機能確認のために、調製したAAVベクターを細胞に感染させ、AAVベクターゲノムの宿主ゲノムへの挿入を検証する。そのため、細胞培養に必要な培養液、試薬類、培養容器等を購入する。また、挿入の解析に必要な試薬類を購入する。また、受精卵に対するAAVベクターの感染条件を検討する必要がある。このために受精卵の採取に必要な製剤類や培養液、試薬類を購入する。

  • Research Products

    (11 results)

All 2013 2012 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (7 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Robust Long-term Transduction of Common Marmoset Neuromuscular Tissue With rAAV1 and rAAV92013

    • Author(s)
      Okada H, Ishibashi H, Hayashita-Kinoh H, Chiyo T, Nitahara-Kasahara Y, Baba Y, Watanabe S, Takeda S, Okada T
    • Journal Title

      Molecular Therapy Nucleic Acids

      Volume: May 28;2 Pages: e95

    • DOI

      10.1038/mtna.2013.21

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Efficient embryo transfer in the common marmoset monkey (Callithrix jacchus) with a reduced transfer volume: a non-surgical approach with cryo-preserved late-stage embryos.2013

    • Author(s)
      Ishibashi H, Motohashi HH, Kumon M, Yamamoto K, Okada H, Okada T, Seki K.
    • Journal Title

      Biology of Reproduction

      Volume: 9;88(5) Pages: 115

    • DOI

      10.1095/biolreprod.113.109165

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Ultrasound-guided non-surgical embryo collection in the common marmoset.2013

    • Author(s)
      Ishibashi H, Motohashi H, Kumon M, Yamamoto K, Okada H, Okada T, Seki K
    • Journal Title

      Reproductive Biology

      Volume: 校正中 Pages: 未決定

    • DOI

      10.1016/j.repbio.2013.02.002

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Effective transfer of morpholino into muscle cells by using AAV empty capsids2012

    • Author(s)
      Hayashita-Kinoh H., Okada H., Chiyo T., Nitahara-Kasahara Y., Okada T., Takeda S.
    • Organizer
      第18回日本遺伝子治療学会学術集会
    • Place of Presentation
      ホテル熊本テルサ, 熊本
    • Year and Date
      20120628-20120630
  • [Presentation] Shakuyaku-kanzo-to promotes recombinant AAV cellular uptake to enhance transduction of cultured mammalian cells2012

    • Author(s)
      Chiyo T., Hayashita-Kinoh H., Nitahara-Kasahara Y., Okada H., Okada T., Takeda S.
    • Organizer
      第18回日本遺伝子治療学会学術集会
    • Place of Presentation
      ホテル熊本テルサ, 熊本
    • Year and Date
      20120628-20120630
  • [Presentation] Effective transgene expression in non-human primate muscle with AAV type 9 vectors following immune suppression2012

    • Author(s)
      Ishii A., Okada H., Hayashita-Kinoh H., Shin J-H., Okada T
    • Organizer
      第18回日本遺伝子治療学会学術集会
    • Place of Presentation
      ホテル熊本テルサ, 熊本
    • Year and Date
      20120628-20120630
  • [Presentation] Strategy for efficient generation of DMD model marmoset with rAAV-mediated transduction2012

    • Author(s)
      Okada H., Ishibashi H., Hayashita-Kinoh H., Chiyo T., Nitahara-Kasahara Y., Okada T., Takeda S.
    • Organizer
      第18回日本遺伝子治療学会学術集会
    • Place of Presentation
      ホテル熊本テルサ, 熊本
    • Year and Date
      20120628-20120630
  • [Presentation] Strategy for rAAV-mediated transduction of common marmoset skeletal muscle to generate NHP DMD model2012

    • Author(s)
      Hironori Okada, Hidetoshi Ishibashi, Hiromi Hayashita-Kinoh, Tomoko Chiyo, Yuko Nitahara-Kasahara, Takashi Okada, and Shin'ichi Takeda
    • Organizer
      American Society of Gene & Cell Therapy 15th Annual meeting
    • Place of Presentation
      Pennsylvania Convention Center, Philadelphia, USA
    • Year and Date
      20120516-20120519
  • [Presentation] rAAV9-Mediated Microdystrophin Gene Transfer with Immune Tolerance Induction Improves Dystrophic Phenotype of Canine X-Linked Muscular Dystrophy2012

    • Author(s)
      Hiromi Hayashita-Kinoh, Naoko Yugeta, Hironori Okada, Yuko Nitahara-Kasahara, Tomoko Chiyo, Takashi Okada, Shin’ichi Takeda
    • Organizer
      American Society of Gene & Cell Therapy 15th Annual meeting
    • Place of Presentation
      Pennsylvania Convention Center, Philadelphia, USA
    • Year and Date
      20120516-20120519
  • [Presentation] rAAV8/9-Mediated Muscle Transduction with Tacrolimus in Non-Human Primate2012

    • Author(s)
      Akiko Ishii, Hironori Okada, Hiromi Hayashita-Kinou, Takashi Okada, Shin’ichi Takeda
    • Organizer
      American Society of Gene & Cell Therapy 15th Annual meeting
    • Place of Presentation
      Pennsylvania Convention Center, Philadelphia, USA
    • Year and Date
      20120516-20120519
  • [Remarks] AAVベクターを用いた遺伝子治療 4.遺伝子導入技術を用いた遺伝子改変動物の作製

    • URL

      http://www.ncnp.go.jp/nin/guide/r_dna2/0okada.html

URL: 

Published: 2014-07-24  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi