2011 Fiscal Year Research-status Report
高等真核生物の転写および複製に対するＤＮＡータンパク質クロスリンク損傷の影響
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23710070
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
中野 敏彰 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (10526122)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | DNA損傷 / 転写 / 複製 |
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| Research Abstract |
DNA-タンパク質クロスリンク(DPC)は、様々なDNA傷害性因子により誘発される普遍的なゲノム損傷である。申請者はこれまでに、DPCの遺伝・細胞伝毒性発現の分子機構を明らかにするため、ファージならびに大腸菌をモデルとして転写・複製影響に関する研究に関する研究を行ってきた。その結果、DPCは、従来のバルキーな損傷とは異なるメカニズムで転写および複製装置の進行を阻害することが明らかとなった。申請研究では、この研究をより高度な転写・複製装置をもつ高等真核生物(哺乳類細胞)に発展させ、転写・複製の阻害機構を解明する。これらの研究から、DPC に代表される巨大DNA付加体(superbulky DNA lesion)に特有な遺伝・細胞伝毒性発現の分子機構を明らかにする。本年度は、まず、DPCの転写影響を明らかにするため、DNA鋳型の調製法と試験管内転写系の確立を行なった。RNA polymerase (RNAP) IIプロモーターを含むプラスミドを用い、転写に必要な領域(1 kbp)をPCR反応で増幅した。この断片にDPC損傷導入予定のDNA(100 bp)を結合することによりDNA鋳型を構築した。また、RNAPIIの転写系を構築するため、HeLa細胞核抽出物を調製した。DNA鋳型と核抽出物を用い試験管内転写を行い、転写産物を変性PAGEで分析した。その結果、全長のrunoff転写産物を確認することができた。さらに、runoff転写産物の生成量がDNA鋳型の量に依存して増加することも確認した。DNA複製影響については、ヘリカーゼ基質としてY字型の複製フォーク構造をもつ基質を調製した。MCMヘリカーゼの結合部位である基質の一本鎖領域の長さを調節することにより、ヘリカーゼ活性がアッセイできることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
転写影響については、DNA鋳型の調製法とRNAPIIの試験管内転写系が確立できた。また、複製影響については、複製フォーク構造をもつDNA基質の調製が完了し、これを用いてMCM467複合体のヘリカーゼ活性が確認された。以上のことから、当初予定していた転写および複製影響に関する研究はおおむね順調に進行していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
転写および複製影響に関する試験管内アッセイ系が確立できたことから、当初の計画に従い研究を進める。DPCのin vivo転写影響の解析については，レポータープラスミドを用いたアッセイ系の構築を重点的に行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
消耗品(試薬・培地、器具類、酵素、アイソトープ、論文別刷り)、旅費 (国内 第35回日本分子生物学会)
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Research Products
(3 results)
