2011 Fiscal Year Research-status Report
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23710270
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
村田 亜沙子 大阪大学, 産業科学研究所, 特任研究員 (50557121)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | マイクロRNA / cell-based セレクション / 低分子化合物 |
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| Research Abstract |
本研究の目的は，「非内在性マイクロRNA（miRNA）を創製し，それを用いて遺伝子の発現を制御する」ことである。この目的を達成するために，平成２３年度は以下の３つの項目に分けて研究を進めることとした。１．人工pre-miRNAライブラリの作製: pre-miRNAライブラリの作製に先立って，pre-miR122配列を組み込んだ発現ベクターを作製した。また，ホタルルシフェラーゼ遺伝子の3’-非翻訳領域（3'-UTR）にmiR122の標的配列を含むレポーターベクターを作製した。レポーターベクターを導入した細胞に，先のpre-miR122発現ベクターを導入すると，ホタルルシフェラーゼの活性が抑制されることを確認した。構築した発現ベクターが，細胞内でpre-miR122を生成させるのに有効であることを確認したので，今後は，pre-miR122 dopedライブラリを含む発現ベクターを調製する。２．レポーター遺伝子，および人工pre-miRNAライブラリを発現する細胞株の作製: ピューロマイシン耐性遺伝子の3’-UTRにmiR122の標的配列を含むレポーターベクターを作製し，HEK293細胞に導入した。この細胞を，1.25～10 μg/mLのピューロマイシン存在下で培養し，耐性株を単離した。現在，1で作製したpre-miR122発現ベクターを導入して薬剤耐性が減少するかどうか確認中である。その後，pre-miR122 dopedライブラリを含む発現ベクターを細胞に導入し，cell-basedセレクションを行う。３. 低分子化合物と人工pre-miRNAとの相互作用をレポーター遺伝子の活性により評価，選別: ２で作製したピューロマイシン耐性株を用いて，化合物に結合する人工pre-miR122の配列を選別する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１. 人工pre-miRNAライブラリの作製: おおむね順調に進展している。しかし，研究計画の若干の変更があった。当初はpre-miR29a doped ライブラリをセレクションに用いる予定であったが，配列中に転写終結シグナルがあることが判明し，断念した。そこで，pre-miR122をランダム化したdopedライブラリを作製することにした。まず，内在性pre-miR122を発現するベクターを作製し，レポーター遺伝子への影響等を調べるコントロール実験を行った。pre-miR122 dopedライブラリを発現するベクターは未だ作製していないが，内在性pre-miR122発現ベクターを作製したのと同様の方法ですぐに達成できる。２．レポーター遺伝子，および人工pre-miRNAライブラリを発現する細胞株の作製: おおむね順調に進展している。ピューロマイシン耐性遺伝子の3’-UTRにmiR122の標的配列を導入したレポーターベクターを構築し，HEK293細胞に導入してピューロマイシン耐性遺伝子の安定発現株を得た。現在，この安定発現株，および，1で作製した内在性pre-miR122発現ベクターを用いて，ピューロマイシンの上限・下限濃度を決定するための実験を行っている。３. 低分子化合物と人工pre-miRNAとの相互作用をレポーター遺伝子の活性により評価，選別: やや遅れている。１，２に示した通り，現在セレクションの条件検討を行っている。よって，pre-miR122 dopedライブラリを発現する発現ベクターの構築には至らず，セレクションを開始できなかった。2でピューロマイシン耐性株の上限・下限濃度を決定した上でセレクションを開始する。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在，cell-basedセレクションを行う上で必要な条件検討を行っている。最適な条件が決定し次第，レポーター遺伝子（ピューロマイシン耐性遺伝子）の安定発現株にpre-miR122 dopedライブラリ発現ベクターを導入し，セレクションを開始する。pre-miRNA dopedライブラリ発現ベクターを細胞に導入する場合，ライブラリに含まれる配列の多様性を維持する必要がある。よって，細胞への遺伝子導入効率や培養スケール等の検討を行い，最適化した条件でライブラリ発現細胞の調製を行う。得られたライブラリ発現細胞は，プールして数種類の化合物を標的としたセレクションに用いる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
研究を進めるにあたって必要に応じて研究費を執行したため，当初の見込み額と執行額は異なったが，研究計画に大きな変更はなく，前年度の研究費も含め，当初予定していた計画に沿って研究を進める。
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