2011 Fiscal Year Research-status Report
酵素前駆体を分子認識素子として利用する電気化学バイオセンシング手法の開発
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23750073
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
井上 久美 東北大学, マイクロシステム融合研究開発センター, 研究支援者 (20597249)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | バイオセンサ / 電気化学 / 酵素前駆体 / チップ型電極 / 生体機能利用 |
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| Research Abstract |
平成23年度は酵素前駆体を用いる電気化学センシング原理の開発を行った． まず，エンドトキシンをモデル検出物質として，カブトガニ血清由来の酵素前駆体（リムルス試薬）を用いる電気化学センシング手法の検討を行った．96穴プレートでリムルス試薬とエンドトキシンを混合して反応させ，遊離するパラニトロアニリンをダイヤモンドライクカーボンパターン電極チップ上で微分パルスボルタンメトリ法にて検出した．その結果，1hrで5 EU/L，2hrで0.5 EU/Lのエンドトキシンを定量的に検出することができた．このことにより，これまでバイオセンサの素子としてほとんど注目されていなかった酵素前駆体を利用すると，従来は電気化学センサで測定が困難だった生理活性物質を高感度に検出できることが示された．さらに複数の酵素前駆体が次々に活性化するカスケード反応を利用すると1000倍以上の感度上昇効果があることが分かった． 次に，新規基質および検出法の開発を行った．これは電気化学測定に有利な基質の開発を行い，最適な電気化学計測法と組み合わせることにより，さらなる高感度の検出を目指すための研究である．検討の結果，Boc-Leu-Gly-Arg-pAPがエンドトキシン検出用に利用できることが判明した．この新規基質を用いることにより，微分パルスボルタンメトリ法よりも簡易な分析アルゴリズムであるアンペロメトリ法での計測が可能になった．これは，実用センサを設計する上で有利である．さらに，基質と生成物の酸化還元電位の特性から，この基質を用いると銀イオンを利用する変換ストリッピング法が適用できることが分かった．小型の電極チップデバイスを作製して変換ストリッピング法によるエンドトキシン検出を行った結果，2hrで0.1EU/Lという超高感度のエンドトキシン定量検出に成功した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
新規基質でストリッピングボルタンメトリ法が採用でき，予想外の高感度化が達成できている．さらに，微分パルスボルタンメトリ法，ストリッピングボルタンメトリ法のいずれの計測においてもチップデバイス化を実現しており，実用型のセンサチップの構造へ応用するための基本的評価が済んでいるといえる．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成24年度は，23年度によい結果が得られた新規基質の開発をさらに進めるとともに，チップ型電極の開発および酵素前駆体試薬のセッティング手法の検討を本格的に行う．新規基質としては，フェロセン誘導体を用いて迅速な酸化還元反応を利用する方法やヒドラジン誘導体を用いて電気化学発光法を利用する方法などの検討を考えている．チップ電極はプラスチック基板の上にカーボンインクを印刷した電極を検討する．さらに，参照電極のチップ上への集積化を検討する．酵素前駆体を電極チップ部へ予めセッティングしておく方法としては，まず凍結乾燥法を検討し，必要に応じて電極表面修飾を用いた固定化法などの検討を行う．また，リムルス試薬以外の酵素前駆体あるいは受容体をセンサ素子として利用し，エンドトキシン以外の対象物を検出する手法を開発するための基礎調査を行い，より一般的な酵素前駆体を分子認識素子として利用する電気化学バイオセンシング手法への展開に向けた研究を開始する． 平成25年度は，実用システムの評価および実サンプルの測定評価を行う．プロトタイプの測定装置と電極チップを用いて，開発したシステムが実用的なセンサとして機能するかどうかの評価を行う．また，透析液や生体試料など夾雑物質がある系でも本手法が利用できることを確認する．夾雑物質が測定に影響する場合は，影響を低減する手法（例えば前処理を行ったりｐＨ調整用の試薬を予め添加したりするなど）を検討する．さらに，エンドトキシン以外の系でのセンシング手法の開発に着手し，本研究終了後の一般的な酵素前駆体や受容体を用いた電気化学バイオセンシング手法の開発研究の端緒となる成果を得る．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成24年度は物品費に880,000円，旅費に50,000円，その他（通信費，研究成果投稿料，英文校正費用）に70,000円を予定している．実験設備はこれまでの研究で使用している東北大学の設備を利用するため，備品の購入行わない．物品費は，酵素前駆体試薬や基質などの生化学試薬，チップ型電極を作製するための電子部品や小型部品，貴金属材料，微細加工に必要な試薬，生化学実験に必要なスライドガラスや遠沈管などのガラス，プラスチック器具などの消耗品を購入するために使用する．また，学会等で研究成果を公表するための旅費および論文投稿をおこなうためにそれぞれ旅費，その他の費用を使用する．
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