2012 Fiscal Year Annual Research Report
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23750083
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
鈴木 宏和 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (80462696)
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| Keywords | メチル化塩基 / メチル化部位分析 / 抗体 |
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| Research Abstract |
微生物におけるメチル化DNA塩基種としては，5-methylcytosine，N6-methyladenine，およびN4-methylcytosineの3種が挙げられる．本研究では，DNAメチル化部位の汎用的分析手法の開発を目的とし，分析手法各種（A:免疫沈降/PCR法，B:被メチル化プラスミドライブラリー/HPLC法，C:被メチル化プラスミドライブラリー/ウェスタンブロット法）を設計した．
平成24年度では，メチル化塩基を導入したリンカーを用いた手法Aを検討した．低頻度N6-methyladenineをもつ大腸菌（HsdM+）染色体のメチル化サイトを分析したが，有意に検出することはできなかった．
次に手法Bを検討した．プラスミドライブラリーを大腸菌JM110（HsdM+）から回収し，デオキシリボヌクレオシドにまで分解した後，逆相HPLCで分析した．AdenineあたりのN6-methyladenineモル比を計測し，理論値と比較したところ，理論値と実測値が一致するものもあったが，全体的には誤差が大きかった．プラスミド純度の影響が大きく，コストパフォーマンスや簡便性の点から手法Bの実用性は低いと結論した．
次に手法Cを検討した．プラスミドDNAをメンブレンにアルカリブロットし，抗N6-methyladenine抗体を用いて検出した．陰性対照のスポットにも若干のシグナルが得られたが，有意なシグナルが得られた．更にシグナル強度はメチル化部位の数に依存した．条件検討によりS/N比の改善は可能と考えられ，手法Cは，従来法では解析が困難であったI型制限修飾系のメチル化部位の解析法に繋がると期待できる．
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