2012 Fiscal Year Annual Research Report
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23770124
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
三島 正規 首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (70346310)
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| Keywords | NMR / 微小管 / チューブリン / チューブリンチロシンリガーゼ |
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| Research Abstract |
微小管の化学修飾が種々の重要な生命現象に関与していることが近年明らかになってきている。本研究ではtubulin tyrosine ligase( TTL)の立体構造解析を行い、チューブリンのチロシン化のメカニズムをその立体構造に基づいて理解し、化学修飾による微小管動態制 御の構造的基礎を得る。また応用として、TTLを用いた高効率なプロテインライゲーション反応の技術を確立することを目的としてい る。
本研究において全長ヒトTTL1の大腸菌による発現系を構築し、精製系を確立した。大量に封入体を形成したことから、シャペロンの共発現系を用いた。これにより最終的な収量を約５倍にすることに成功した。13C,15N,2Hラベルした蛋白質を調製し、多次元NMR測定に取り組んだ。当初、NMR測定温度でTTL1が凝集を起こし、NMRスペクトルも極めて分離の悪いものであったが、buffer条件の検討を行い、現 在までに測定温度で凝集が起こらず、NMR信号の分離のよい条件を見つけることができた。並行して、緑色蛍光タンパク質GFPとTTL1を 融合させることで、コロニーレベルでTTL1の安定を検討するシステムの開発にとりくんだ。2011年の秋にはアメリカのグループよりゼノパスのTTLの結晶構造構造が報告された。ゼノパスとヒトでの配列を比較することで、ヒトTTL1の変異体を作成したところ、安定性が劇的に向上した。この変異体についても13C,15N,2Hラベルした蛋白質を調製し、多次元NMR測定に取り組んだ。またアルファチューブリンのC末端領域の発現系を構築、標識試料を調製し、NMRチューブ内でチロシン化反応を行い、リアルタイムでのTTLの活性をモニターする系を確立した。
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