２成分Ｋ＋／Ｈ＋アンチポーターＹｈａＴＵの大量精製系の確立と作用機序の解明

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 23770156
• Research Institution: Toyo University
• Principal Investigator: 藤澤 誠 東洋大学, 食環境科学部, 准教授 (70549641)
• Keywords: アンチポーター / チャネル / 部位特異的変異 / タンパク質精製

Research Abstract

枯草菌が持つ2成分K+/H+アンチポーターYhaTUシステムは親水性タンパク質であるYhaTと膜タンパク質であるYhaUからなる。YhaUを大腸菌内で単独で発現させるとカリウムイオンチャネル様の働きをするが、YhaTとYhaUを共発現させると、K+/H+アンチポーターとしての機能を示す。そのため、受動輸送体であるチャネルから能動輸送体であるアンチポーターへの進化という点において興味深いトランスポーターである。
以前の研究において、YhaTのN末端側にStreptTagIIを、YhaUのC末端側にHis6タグを付与したペプチドタグ融合型YhaTUは、K+/H+アンチポート活性を保持していることが明らかとなっている。また、このペプチドタグ融合型YhaTUを用いて、YhaTとYhaUが相互作用していることは、すでにプルダウンアッセイとブルーネイティブゲル電気泳動により確認している。本研究では、(1)このペプチドタグ融合型YhaTUの精製系の構築と、(2)部位特異的変異導入による機能解析を行うことを目的としている。
(1)においては、平成23年度の研究で、精製過程途中にYhaTとYhaUが解離してしまうことが明らかとなった。そこで平成24年度には、YhaTのN末端側またはC末端側にHis6タグを付与した遺伝子とYhaUのC末端側にStrepTagIIを融合した遺伝子をクローニングした。また、YhaTおよびYhaUの内部アミノ酸配列を用いてポリクローナル抗体を作成した。
(2)においては、平成25年度までに70変異のうち54変異を取得することに成功した。一方で、残りの16変異についてはクローニングが完了しなかった。