2012 Fiscal Year Annual Research Report
一分子計測法による複製フォークDNA特異的モーター蛋白質の機能解析
Project/Area Number |
23770204
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Research Institution | Kyoto University |
Principal Investigator |
韓 龍雲 京都大学, 物質-細胞統合システム拠点, 助教 (50566297)
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Keywords | 一分子解析 / ナノ開口基板 / DNAヘリケース / ヌクレオソーム / DNA蛍光標識 |
Research Abstract |
高精度で蛋白質やDNAの動きを計測、制御できる一分子計測技術を用いて、大腸菌のUvrDというDNAヘリケースやHolliday構造DNAの分岐点移動を促進するモーター蛋白質であるRuvBの機能解析を行った。UvrDは蛍光標識されたATPを加水分解して、二本鎖DNAをほどくことを確認した。RuvB蛋白質については活性を保持した蛍光標識されたRuvBの作製に成功し、RuvBの六量体形成過程に関する研究を行った。 RuvBの六量体形成には高濃度のRuvBが必要で、一分子レベルでの解析には新たな一分子蛍光イメージング技術が必要となり、本研究ではナノ開口基板と呼ばれる、次世代DNAシークエンサーに用いられる技術を応用して、Holliday構造DNA上でのRuvBの複合体が形成している様子を観察することに成功した。また、ADPやATPγS等の様々なヌクレオチドを用いることで、RuvBがどのような状況で、より六量体形成を促進するのかを明らかにすることができた。現在はこのRuvBの研究については論文投稿準備中である。 また、本研究において、DNA塩基配列特異的にDNAと相互作用する小化合物Pyrrole-Imidazole (PI) polyamideを用いた研究を行った。蛍光標識したPI polyamideをNucleosomeに加えることで部位特異的にNucleosomeを蛍光標識することが可能となり、このような部位特異的に蛍光標識されたNucleosomeを用いて、Nucleosomeの動的変化を蛍光エネルギー移動効率を指標に解析することに成功しました(現在、論文投稿準備中)。また、この研究過程でPI polyamideの構造とDNAに対する結合解離のKineticsの関連性を明らかにすることに成功し、Nucleic Acids Research誌に発表した。
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Research Products
(8 results)