2011 Fiscal Year Research-status Report
タンパク質の輸送と品質管理を制御する分子ネットワークの解明
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23770217
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
水野 智亮 筑波大学, 医学医療系, 助教 (80529032)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | 小胞体ストレス / 小胞体輸送 / 出芽酵母 / シグナル伝達 |
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| Research Abstract |
膜タンパク質・分泌タンパク質が正常に機能する上で、小胞体の適切な機能は不可欠であり、小胞体に入るタンパク質の種類と量を決める段階（小胞体輸送機構）と小胞体から出るタンパク質の品質を確認する段階（品質管理機構）の制御は重要である。申請者は、出芽酵母を用いた分子遺伝学的解析から、Kin1、Kin2、Ire1、Hac1がタンパク質の小胞体輸送と品質管理を制御する可能性を見出してきた。しかしながら、これらの因子が実際どのような分子メカニズムで機能しているかは不明であった。そこで本研究では、これらの因子によるタンパク質の小胞体輸送と品質管理の制御機構を明らかにすることを目的とし、本年度はKin1・Kin2の機能解析を中心におこなった。まず、Kin1・Kin2がIre1-Hac1経路を介し機能しているかを検討するため、レポーター遺伝子を用いてHac1活性を測定した。その結果、Kin1・Kin2二重変異株におけるレポーター遺伝子の発現は野生株と同程度であったことから、Kin1・Kin2はIre1-Hac1経路を介していないと考えられた。次に、Kin1・Kin2はいずれもキナーゼであることから、そのキナーゼ活性の重要性を検討した。その結果、Kin1・Kin2二重変異株の小胞体ストレス昂感受性表現型は、野生型Kin1・Kin2の過剰発現によって救済されたのに対し、キナーゼ不活性化型Kin1・Kin2の過剰発現によって救済されなかったことから、Kin1・Kin2はキナーゼ活性依存的に機能すると考えられた。次に、Kin1・Kin2の作用機序を明らかにするため、Kin1・Kin2二重変異株の小胞体ストレス昂感受性表現型に対するマルチコピーサプレッサーの探索をおこなった。その結果、Kin1・Kin2二重変異株のマルチコピーサプレッサーとして１０遺伝子を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Kin1・Kin2二重変異株のマルチコピーサプレッサーとして１０遺伝子を同定しており、Kin1・Kin2の作用機序を明らかにできる見込みが出てきたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
Kin1・Kin2の周辺で機能する因子をさらに探索するため、kin1kin2二重欠損との合成致死変異体の分離とその原因遺伝子の同定、および、免疫沈降法を用いたKin1・Kin2結合因子の同定をおこなう。Kin1・Kin2の下流で機能する因子の機能解析をおこなうため、スクリーニングで分離・同定した因子群からのKin1・Kin2によってリン酸化される因子を抽出し、リン酸化部位の同定とリン酸化部位変異の生理的効果の検討をおこなう。Kin1・Kin2とIre1・Hac1の関連性を明らかにするため、遺伝学的解析による各因子の上下関係の検討とDNA microarray法による遺伝子発現変化の比較をおこなう。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
申請時の研究計画では、平成２３年度にDNA microarray法による遺伝子発現解析をおこなう予定であり、それに用いるDNAマイクロチップの購入費約７５万円を消耗品費に含めて計上していた。しかしながら、平成２３年度は遺伝学的解析に専念し、DNAマイクロチップを購入しなかったため、消耗品費の一部を平成２４年度に繰り越した。平成２４年度の研究費は、主に消耗品と抗体作製に使用する。消耗品には、申請時に計画していた品目（培地、耐熱性ポリメラーゼ、制限酵素、修飾酵素、市販抗体、染色用試薬、および、遺伝子工学用のチップ、チューブなどのプラスチック器具）に加えてDNAマイクロチップを含める。抗体作製費は、Kin1・Kin2によってリン酸化される因子の機能解析をおこなう上で、リン酸化型タンパク質に対する特異的な抗体が極めて有効なツールであることから計上した。
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