2012 Fiscal Year Annual Research Report
細胞サイズリポソームへの最少要素シグナル伝達経路の構成と作用因子解析
| Project/Area Number |
23770222
|
|---|
| Research Institution | Mie University |
|---|
Principal Investigator |
湊元 幹太 三重大学, 工学(系)研究科(研究院), 講師 (80362359)
|
|---|
| Keywords | 人工細胞モデル / 巨大リポソーム / シグナル伝達 / 膜タンパク質再構成 / バキュロウイルス / GUV / 少数要素による構成実験 / 細胞情報 |
|---|
| Research Abstract |
前年度に引き続き、膜タンパク質要素、脂質要素、細胞質要素を、巨大リポソームに個別に組み込んだシステムを作製、最少要素からなるシグナル伝達経路での機能発現を捉えることを、巨大リポソーム（GUV）レベルで行えるよう、試みた。Gタンパク質共役受容体（GPCR）から、その下流タンパク質（Gタンパク質（Gαs）、アデニル酸シクラーゼ（ADCY））へ流れるシグナルの生化学アッセイによる検出については、その弱さ（精度良い結果の再現性の弱さ）が、前年度、問題となった。そこで、それを克服すべく、単一GUVレベルでの直接検出の実現へ、研究を進めた。具体的には、バキュロウイルス粒子（BV）上への目的タンパク質の発現、BV‐リポソーム膜融合によるGUVへのタンパク質の組込、および膜上での要素間相互作用や共局在の確認が可能となるよう、RFPやGFP等の蛍光タンパク質などをC末端タグとして融合したGPCR（ADRB2、CRHR1）、GβおよびADCY6、経路上下の要素との相互作用を阻害しない箇所にタグを挿入したGαsを構築した。レーザー共焦点蛍光顕微鏡による単一GUV観察により、GPCR、ADCY6が、GUVとBVの融合を経て、GUV膜に移行し、プロテオリポソームが得られたことを確認している。
一方、前年度、人工細胞モデル研究の進展に役立つよう、巨大リポソーム実験法への改良の試みにも取り組み、ゲル包埋型の巨大リポソームを作り、膜流動性などに瑕疵なく、酵素反応や膜動態の追跡などの実験に利用できることが分かったが、内水相への物質取込みの促進も、以降の実験系の改良に重要な課題の一つと考え、特にタンパク質の要素の取込効率を高める手法（pH転換によるGUVへの取込促進）を見出した。今後、これらの手法と、上記の要素組込み技術とを組合せて、少数要素シグナル伝達経路構成実験系の改良をめざしていく。
|
