2011 Fiscal Year Research-status Report
Ｎｏｔｃｈ下流の新規因子Ｎｅｐｒｏの機能と神経幹細胞の解析
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23770242
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
室山 優子 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任講師 (20422248)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | 発生・分化 / 脳・神経 / 神経幹細胞 / Notch / 大脳皮質 / 遺伝子 |
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| Research Abstract |
大脳形成初期の神経幹細胞の維持機構を明らかにすべく、研究代表者らが同定した大脳形成初期の神経幹細胞の維持に必須なNotch下流の新規因子Neproの機能ドメインの解析と発現制御機構の解析を進めた。マウス胎児への電気穿孔法を用いて、Neproを胎児の大脳で強制発現させると、脳室層の神経幹細胞は維持される。一方、NeproのC末端側の領域を欠損させると神経幹細胞は維持できず、NeproのsiRNAを発現させた場合と同様に神経細胞への分化が促進されることから、C末端側の領域はNeproの機能に必須であると考えられた。そこで、C末端側領域に存在するNeproの核移行シグナルに変異を導入したところ、神経幹細胞を維持する活性が失われることが明らかになった。このことから核移行がNeproの機能に重要であることが示唆された。また、Neproの生体内局在の解析と生化学的な解析に用いる特異的な抗体を得るため、NeproとGSTタグの融合タンパク質を大腸菌で発現させて、ウサギに免疫することによりポリクローナル抗体を作製した。さらにアフィニティー精製を行い、免疫組織化学に使用できる抗体を得ることに成功した。その抗体を用いた解析により、Neproタンパク質はマウス大脳形成初期の神経幹細胞で発現することが明らかになった。さらに、Neproの発現制御機構を明らかにするため、蛍光タンパク質をコードする遺伝子の上流にNeproゲノムDNA断片を挿入したレポーターベクターを構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画のNotch下流の新規因子Neproの分子機作の解析に関し、機能ドメインの解析から新たに核移行シグナルの重要性を示し、分子機作の解明の糸口が得られた。さらに、Neproに対する特異的な抗体を得て、Neproの生体内局在が明らかになった。この抗体は生化学的な解析にも使用可能であると考えられる。また、Nepro発現制御機構を明らかにすべく、レポーターベクターの構築も進み、当初の大きな目的をほぼ達成している。
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| Strategy for Future Research Activity |
NotchカスケードにおけるNeproの分子機作を明らかにすべく、Neproの機能ドメインと相互作用する因子の探索や、Notchカスケードの主要な下流因子であるHesとの相互作用を解析する。また昨年度作製した特異的抗体を用いてNeproの生体内局在を明確にするとともに、神経幹細胞の制御に関わる因子に対する抗体を用いて共染色することにより、他の因子との関係を明らかにする。Neproの発現制御機構を明らかにすべく、昨年度作製したレポーターベクターをもとに、Neproのゲノム領域で転写制御因子が結合しうる領域を欠損させたコンストラクトを複数作製し、電気穿孔法を用いて胎児大脳で発現させ、大脳神経幹細胞での発現の有無や発現細胞の動態を解析する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本研究では、Neproの分子機作の解析及び電気穿孔法を用いた発現細胞の解析が主な課題であり、分子生物学および細胞生物学実験と動物実験が主となる。研究に必要な最低限の機器は揃っており、次年度研究経費は消耗品と研究成果発表のための旅費、研究成果投稿費に用いる。
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