プロテオミクスによる白色腐朽菌の選択的リグニン分解機構と鍵代謝物生合成系の解明

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23780183
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 渡邊 崇人 京都大学, 生存圏研究所, 助教 (30362403)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2014-03-31
• Keywords: リグニン / 白色腐朽菌 / 脂質関連代謝物 / プロテオーム

Research Abstract

選択的リグニン分解菌 Ceriporiopsis subvermispora は，培養条件によっては大量のゼラチン様物質を菌体に覆う形で生育する．この物質はろ過等で菌体から剥がすことが容易にできない．また，大量に水分を含むため，そのゼラチン様物質が付着した菌体を液体窒素で凍結し，破砕を行ってもその物質が凍ってしまう関係で菌体自体の破砕を大きく妨げている．以上のような原因で本菌の菌体内タンパク質の抽出を非常に悪くしている．そこで，菌体を覆うゼラチン様物質を除去する方法を検討した．菌体の洗浄，洗浄後の菌体のろ過，そして，破砕法を変更することでゼラチン用物質の除去ができ，タンパク質の抽出効率も上げることができた．　次に，この確立した抽出法を用いて，ゼラチン様物質の産生が認められるバニリン（主要なリグニン分解産物）添加時の菌体から二次元電気泳動に供することができるタンパク質を抽出できるか検討を行った．その結果，糖鎖修飾によると思われるタンパク質のスポットの乱れが若干認められるものの二次元電気泳動法による発現差のあるタンパク質の解析に耐えうるプロファイルを得ることに成功した．　さらに，バニリン添加時の C. subvermispora の細胞応答を見る目的で発現差のある遺伝子の解析をサプレッションサブトラクションハイブリダイゼーション法を用いて行った．今回はバニリン添加によって転写量が上昇する遺伝子の濃縮と真に発現差が認められる遺伝子の絞り込みを行った．その結果，約 100 個の発現差のある遺伝子クローンを取得した．得られたクローンの配列を基に近年公開された C. subvermispora のゲノムデータベースを用いて相同性検索を行ったところ約 40 個の遺伝子については機能を推定できた．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

二次元電気泳動法の成功の鍵はタンパク質の調製に大きく依存する．これまでは，Ceriporiopsis subvermispora のタンパク質を調製して，二次元電気泳動に供しても一次元目の等電点電気泳動の段階でトラブルが生じたり，調製できる菌体内タンパク質の量が少量で発現量の少ないタンパク質のスポットが検出できないなどの問題が多々あった．しかしながら，今年度はタンパク質の抽出方法が大幅に改善したことから，C. subvermispora の菌体内タンパク質の二次元電気泳動を行えるようになった．バニリン以外の基質添加時のプロファイル取得については試すことができなかったもののおおむね研究実施計画通りと思われる．　また，バニリン添加時の発現差のある遺伝子の取得については，サプレッションサブトラクションハイブリダイゼーション法の反応系が良好に動いたことから，発現差のある遺伝子クローンの取得に成功し，計画通り研究を遂行できた．

Strategy for Future Research Activity

プロテオミクスを含む網羅的な解析においては，「再現性」と「定量性」が求められる．二次元電気泳動では，同一泳動条件で泳動を試みても，同一のタンパク質のスポットでさえその位置がずれると言ったゲル間で発生する「泳動のばらつき」がある．原因は「サンプルの不均一性」，「電気泳動の操作から生まれるばらつき」，「サンプルの添加量」等が指摘されている．これらの要素がある状態では再現性に大きく不安が残る．そこで，複数のサンプルを異なる蛍光標識色素で標識し，一枚のゲルで泳動分離する蛍光標識ディファレンスゲル二次元電気泳動法を今後試みる．定量性については，タンパク質を蛍光標識する場合，その量は蛍光シグナルで測定できる．しかも，通常の染色よりも蛍光色素標識の方がダイナミックレンジが広いので定量性も良いと思われる．以上により，発現差のあるスポットを正確に特定できるようになれば，質量分析を用いた一連のタンパク質の同定作業へ不安なく進むことができる．　一方，転写レベルでの発現差のある遺伝子の同定については，前年度のサプレッションサブトラクションハイブリダイゼーション法を用いて得られた遺伝子クローンのアノテーション作業を引き続き詳細に行い，機能の推定が行えるかを試みる．また，興味ある遺伝子，特に，鍵代謝物である ceriporic acid の生合成系酵素を初め Ceriporiopsis subvermispora のリグニン分解機構に関与すると推定される酵素遺伝子については，個々に発現，或いは，機能解析を行う．

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

研究費の使用については，まず，「物品費」は研究の進捗状況に合わせて，主に生化学実験，遺伝子工学実験で使用されている汎用性の高い試薬の購入に充てる．特に，次年度からは本格的に蛍光標識ディファレンスゲル二次元電気泳動法を行う予定であるので，その際，専用の蛍光試薬を使用することが必要であり，しかも，単価が高額なために生化学実験試薬の経費が多くなる．「旅費」は，学会での研究成果発表と資料収集，さらに，二次元電気泳動や研究結果の情報処理（MASCOT 解析）等の技術講習会の参加等に使用する．その他，DNA 合成，DNA 塩基配列決定の委託費，学会参加費や成果発表費用に充てる．

Research Products

• [Journal Article] Comparative genomics of Ceriporiopsis subvermispora and Phanerochaete chrysosporium provide insight into selective ligninolysis (2012)
  • Author(s): Fernandez-Fueyo, E., Ruiz-Duenas, F. J., Ferreira, P., Floudas, D., Hibbett, D. S., Canessa, P., Larrondo, L. F., James, T. Y., Seelenfreund, D., Lobos, S., Polanco, R., Tello, M., Honda, Y., Watanabe, T., Watanabe, T., Ryu, J. S., Kubicek, C. P., Schmoll, M., Gaskell, J., Hammel, K. E., St John, F. J., Vanden Wymelenberg, A., Sabat, G., Splinter BonDurant, S., Syed, K., Yadav, J. S., Doddapaneni, H., Subramanian, V., Lavin, J. L., Oguiza, J. A., Perez, G., Pisabarro, A. G., Ramirez, L., Santoyo, F., Master, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B., Lombard, V., Magnuson, J. K., Kues, U., Hori, C., Igarashi, K., Samejima, M., Held, B. W., Barry, K. W., LaButti, K. M., Lapidus, A., Lindquist, E. A., Lucas, S. M., Riley, R., Salamov, A. A., Hoffmeister, D., Schwenk, D., Hadar, Y., Yarden, O., de Vries, R. P., Wiebenga, A., Stenlid, J., Eastwood, D., Grigoriev, I. V., Berka, R. M., Blanchette, R. A., Kersten, P., Martinez, A. T., Vicuna, R., Cullen, D
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A Volume: 109 Pages: 5458-5463
  • DOI: 10.1073/pnas.1119912109
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 選択的白色腐朽菌 Ceriporiopsis subvermispora のリグニン分解フラグメントに対する転写応答及び代謝物解析 (2012)
  • Author(s): 森賢一郎
  • Organizer: 第62回日本木材学会大会
  • Place of Presentation: 北海道大学（札幌）
  • Year and Date: 2012年3月17日