2012 Fiscal Year Annual Research Report
クルマエビ腫瘍壊死因子のシグナル制御および免疫応答誘導能の解析
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23780207
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| Research Institution | Fisheries Research Agency |
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Principal Investigator |
米加田 徹 独立行政法人水産総合研究センター, その他部局等, 研究員 (40597944)
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| Keywords | クルマエビ / 生体防御 / プロテオーム解析 / 腫瘍壊死因子 / RNA干渉 |
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| Research Abstract |
クルマエビTNFのmRNAの発現様式をRT-PCRにより解析し、スプライシングバリアントの有無を明らかにし、組換えTNFの作製に使用する遺伝子配列の決定を行った。また、組換えTNFの発現および精製条件の最適化を行った。さらにクルマエビTNFの受容体の探索および，TNF組換えタンパク質導入後あるいはRNA干渉法によるノックダウン後に，タンパク質発現量が変動する因子の探索を目的とした。
クルマエビTNFの遺伝子発現解析を臓器別に行い，それぞれ得られた増幅産物の遺伝子配列を解析したところ，当初同定されたタイプの他に3タイプのスプライシングバリアントが確認された。細胞外領域を用い質発現ベクターを構築し，組換タンパク質を作製し、Hisタグカラムによる精製を行った。TNF遺伝子に特異的なT7配列付加プライマーを設計し，二本鎖RNAの作製を行った。TNFの膜貫通領域を除いた遺伝子を増幅し， two-hybrid用 発現ベクターに組込みベイトおよびクルマエビのcDNAライブラリーを構築した。
クルマエビTNF組換え酵母とクルマエビcDNAライブラリーの組換え酵母との接合により得られた酵母のシークエンス解析を行ったが、TNF受容体のホモログと推定される遺伝子配列は認められなかった。しかし、エビ類ESTデータベースよりTNF受容体の全長を得ることに成功した。
TNF組換タンパク質を用い、クルマエビへのTNF接種後の経時的なサンプリングを行った。またTNFの二本鎖RNAを接種後3日目にサンプリングを行い、TNFノックダウンクルマエビのサンプルを得た。対照区には緑色蛍光タンパク質の二本鎖RNAを接種した。これらの全てのサンプルからリンパ様器官の摘出およびISOGENによるタンパク質の精製を行い二次元電気泳動に供した。その結果、TNFノックダウン時において、特異的に発現するスポットが確認された。
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