2011 Fiscal Year Research-status Report

プリオン蛋白質相互作用分子群の探索による異常プリオン蛋白質生成機構解析

Research Project

Project/Area Number	23780313
Research Institution	National Agriculture and Food Research Organization
Principal Investigator	岩丸祥史独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究所・プリオン病研究センター, 主任研究員 (20355142)
Project Period (FY)	2011-04-28 – 2013-03-31
Keywords	プリオン / 脂質ラフト / 界面活性剤不溶膜画分 / DRM / N2a細胞 / GPIアンカー / ビオチン
Research Abstract	病原体"プリオン"の主要な構成成分は、異常プリオン蛋白質（PrPSc）であり、宿主に発現している正常プリオン蛋白質（PrPC）の立体構造が変換したものである。そのため、PrPCの相互作用分子を同定することは、立体構造変換機構を理解するうえで極めて重要である。申請者はPrPCの相互作用分子群の検索、同定を行なっている。プリオン病の細胞感染モデルとして汎用されているN2a細胞を、HRP標識抗PrPC抗体を用いて標識した。標識後の細胞を回収し、4℃で界面活性剤を含む緩衝液に懸濁後、サンプルを高濃度ショ糖溶液に混和し、ショ糖密度勾配遠心法により分画した。各分画中のコレステロール、ガングリオシドGM1、PrPCを検出することで、界面活性剤不溶膜(DRM)画分を決定した。DRM画分にアリルアジドビオチンを添加し、HRPを中心として半径約300 nmの範囲に存在する分子をビオチン標識した(EMARS反応)。標識後のDRM画分中の蛋白質をトリクロロ酢酸で濃縮後、固定化pH勾配ゲルストリップを用いた2次元電気泳動により分析した。HRP標識ストレプトアビジンを用いてビオチン標識蛋白質を検出した。その際、生細胞表面上のPrPCを認識しない抗PrPC抗体とコレラ毒素のBサブユニットを用いて標識したサンプルを陰性対照とし、候補分子の絞り込みを行った。その結果、分子量約22kDa等電点がpH8の位置に、1つのスポットが検出された。しかし、サンプル量不足から、同定されたスポットに一致する蛋白質を銀染色で検出できなかった。このため、上記の行程を約1ヶ月かけ8回繰り返し、集積した標識済みのサンプルを液相等電点電気泳動により分画・濃縮した。その後、固定化pH勾配ゲルストリップを用いた2次元電気泳動を行い、目的蛋白質を銀染色で検出後回収し、質量分析により同定を行なっている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 再現性高くDRMが分取できており、EMARS反応によりPrPCに相互作用している蛋白質にビオチン標識が行えることを確認した。更にPrPCの相互作用分子の候補蛋白質を検出し、現在質量分析による同定を行なっているため。
Strategy for Future Research Activity	平成23年度に得られた結果を元にして同定した相互作用分子と正常プリオン蛋白質の相互作用の確認を行う。細胞免疫組織化学法による解析では、N2a細胞をパラホルムアルデヒド固定後、同定したプリオン蛋白質相互作用分子に対する抗体と抗プリオン蛋白質抗体との二重免疫染色を行ない、共焦点レーザー顕微鏡で両者の共局在を検討する。PLA (Proximity Ligation Assay)法による解析では、N2a細胞を固定後、同定したプリオン蛋白質相互作用分子の抗体とプリオン蛋白質抗体を作用後、核酸が結合した2次抗体を作用させる（Duolink, Olink社製）。2種類の2次抗体が近接（約40 nm）している場合、核酸のライゲーション反応が生じ、環状構造が形成される。環状構造に沿って1本鎖核酸を伸長させ、ここに蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ共焦点レーザー顕微鏡で観察する。さらに同定した相互作用分子群の異常プリオン蛋白質生成への関与の検討を行う。siRNAを用いたRNA干渉により、同定した相互作用分子の発現を低下させ、異常プリオン蛋白質生成への影響を検討する。以上の実験から得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	本研究課題の推進のため、次年度の研究費は、交付申請時の計画どおり使用する。