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2011 Fiscal Year Research-status Report

FF Hybridプローブを用いた遺伝子発現の高感度,高精度,網羅的解析法の開発

Research Project

Project/Area Number 23790061
Research InstitutionUniversity of Shizuoka

Principal Investigator

轟木 堅一郎  静岡県立大学, 薬学部, 准教授 (70341451)

Project Period (FY) 2011-04-28 – 2013-03-31
Keywords遺伝子解析 / HPLC / フルオラス化学
Research Abstract

遺伝子発現量解析用プローブとして,オリゴDNAの両端に親フッ素性のフルオラスタグと蛍光物質フルオレセイン(FAM)を付加したFF hybridプローブを新たに開発した。本プローブとサーマルサイクラー,そしてフルオラスHPLC-蛍光検出システムを組み合せることで,既存のリアルタイムPCRと比較して感度,精度,網羅性に優れた遺伝子発現解析法を確立した。平成23年度は,(1)ハウスキーピング遺伝子解析用FF hybridプローブの合成,(2)同プローブ群を用いた各種条件(PCR反応条件,HPLC分離条件など)設定,分析バリデーションを行い,遺伝子発現量解析法としての有用性を評価した。その結果,FF hybridプローブの添加により,各遺伝子のcDNA量とPCR反応サイクル数に応じたFAM標識モノヌクレオチド(AMP,CMP,TMP)がそれぞれ遊離された。これらのHPLC-蛍光検出による分析結果をもとに,増幅サイクル数と蛍光強度の関係をプロットすることで,リアルタイムPCRと同様の増幅曲線を描けた。この増幅曲線から検量線を作成すると,各遺伝子に対し少なくとも10-100 ngの範囲で良好な定量性を示した。本法はプローブの構造を変えることでさらに多くの遺伝子量を同時定量することが可能であることから,今後,本法によるサイトカイン遺伝子群(IL,TNF-α,IFNなど)の同時発現解析などへの応用が期待できる。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画に記載の通りに実施することができた。また当初,本研究の遂行に際し問題となりうると考えていた(1)FF hybridプローブの水系緩衝液に対する低い溶解性,(2)TaqDNAポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性が十分に機能しない,(3)1つのPCR反応液に高濃度のプローブ・PCRプライマーが存在することによるTaq PCRポリメラーゼ活性自体の阻害の可能性,なども認められなかった。次年度の実施項目であるサイトカイン関連遺伝子の解析に向けて,必要なFF hybridプローブも既に受託合成済みであり,研究の遂行に問題はないと考える。

Strategy for Future Research Activity

現時点ではH24年度の研究実施について,計画書記載の通りに実施することで問題なく成果が得られると考えている。しかし,申請者は分析化学を専門としているため,不足しがちな分子生物学的手技やサイトカイン解析結果の考察には所属機関や前所属機関の共同研究者に適宜指導・助言を仰ぐ。また,申請者にとって必要となる専門知識・技能の習得を目的として,日本分子生物学会,企業主催セミナーなどに積極的に参加・討論する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

受領した研究費は,申請書記載の使用計画に則って適切に使用する。研究費は主に消耗品である関連試薬(分子生物学関連,HPLC関連)の購入に充てるが,関連学会(日本薬学会,日本分析化学会,クロマトグラフィー科学会,フルオラス科学研究会,CASSS - An International Separation Science Society-等)及への成果発表用旅費や,投稿論文の英文校閲料等にも使用する。

  • Research Products

    (26 results)

All 2011

All Journal Article (7 results) (of which Peer Reviewed: 7 results) Presentation (19 results)

  • [Journal Article] Liquid chromatographic determination of aminopolycarboxylic acids in wate samples based on intramolecular excimer-forming fluorescence derivatization2011

    • Author(s)
      Kenji Katoh, Tadashi Hayama, Miki Itoyama, Kenichiro Todoroki, Hideyuki Yoshida, Masatoshi Yamaguchi, Hitoshi Nohta
    • Journal Title

      Bunseki Kagaku

      Volume: 60 Pages: 39-44

    • DOI

      10.2116/bunsekikagaku.60.39

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Selective determination of cysteines through precolumn double-labeling and liquid chromatography followed by detection of intramolecular FRET2011

    • Author(s)
      Makoto Yoshitake, Hitoshi Nohta, Naoko Sejima, Kenichiro Todoroki, Hideyuki Yoshida and Masatoshi Yamaguchi
    • Journal Title

      Analytical and Bioanalytical Chemistry

      Volume: 399 Pages: 1665-1675

    • DOI

      10.1007/s00216-010-4461-6

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Fluorous derivatization and fluorous-phase separation for fluorometric determination of naproxen and felbinac in human plasma2011

    • Author(s)
      Yohei Sakaguchi, Hideyuki Yoshida, Tadashi Hayama, Makoto Yoshitake, Miki Itoyama, Kenichiro Todoroki, Masatoshi Yamaguchi, Hitoshi Nohta
    • Journal Title

      Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis

      Volume: 55 Pages: 176-180

    • DOI

      10.1016/j.jpba.2011.01.011

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Selective liquid-chromatographic determination of native fluorescent biogenic amines in human urine based on fluorous derivatization2011

    • Author(s)
      Yohei Sakaguchi, Hideyuki Yoshida, Tadashi Hayama, Miki Itoyama, Kenichiro Todoroki, Masatoshi Yamaguchi, Hitoshi Nohta
    • Journal Title

      Journal of Chromatography A

      Volume: 1218 Pages: 5581-5586

    • DOI

      10.1016/j.chroma.2011.05.076

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Highly sensitive capillary electrophoresis analysis of N-linked oligosaccharides in glycoproteins following fluorescence derivatization with rhodamine 110 and laser-induced fluorescence detection2011

    • Author(s)
      Soichiro Ijiri, Kenichiro Todoroki, Hideyuki Yoshida, Takashi Yoshitake, Hitoshi Nohta, Masatoshi Yamaguchi
    • Journal Title

      Electrophoresis

      Volume: 32 Pages: 3499-3504

    • DOI

      10.1002/elps.201100258

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Highly sensitive and selective derivatization LC method for biomolecules based on fluorescence interactions and fluorous separations2011

    • Author(s)
      Kenichiro Todoroki, Hideyuki Yoshida, Tadashi Hayama, Miki Itoyama, Hitoshi Nohta, Masatoshi Yamaguchi
    • Journal Title

      Journal of Chromatography B

      Volume: 879 Pages: 1325-1337

    • DOI

      10.1016/j.jchromb.2010.11.038

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Development of Novel Fluorescence-Derivatization-HPLC Methods Enabling Highly Sensitive and Selective Analysis of Biological Compounds2011

    • Author(s)
      Kenichiro Todoroki
    • Journal Title

      Yakugaku Zasshi

      Volume: 131 Pages: 1207-1211

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] LC-MSによる光学活性カルボン酸分離分析のための市販のキラル化合物の評価2011

    • Author(s)
      筒井陽仁、藤井慎也、閔 俊哲、轟木堅一郎、豊岡利正
    • Organizer
      第24回バイオメディカル分析科学シンポジウム
    • Place of Presentation
      大山
    • Year and Date
      2011年9月1日
  • [Presentation] ヒト毛髪中D,L-アミノ酸の迅速分析2011

    • Author(s)
      閔 俊哲、諸田有佳、保坂大樹、轟木堅一郎、豊岡利正
    • Organizer
      第24回バイオメディカル分析科学シンポジウム
    • Place of Presentation
      大山
    • Year and Date
      2011年9月1日
  • [Presentation] クーロアレイ型電気化学検出器を用いた唾液中の酸化・還元物質の網羅的測定2011

    • Author(s)
      山崎朝子、豊岡利正、閔 俊哲、轟木堅一郎:
    • Organizer
      日本分析化学会第60年会
    • Place of Presentation
      名古屋
    • Year and Date
      2011年9月16日
  • [Presentation] フェネチルアミン系乱用薬物の光学異性体分離分析2011

    • Author(s)
      谷口さゆり、平島晴生、稲垣真輔、閔 俊哲、轟木堅一郎、豊岡利正、花尻瑠理、合田幸広
    • Organizer
      日本分析化学会第60年会
    • Place of Presentation
      名古屋
    • Year and Date
      2011年9月16日
  • [Presentation] 健常人及び癌患者の爪中ポリアミンの分析2011

    • Author(s)
      松本暁人、閔 俊哲、東達也、轟木堅一郎、豊岡利正
    • Organizer
      第9回次世代を担う若手のためのフィジカル・ファーマフォーラム(PPF2011)
    • Place of Presentation
      箱根
    • Year and Date
      2011年9月13日
  • [Presentation] Fluorous Scavenging Derivatization法による高極性有機酸の高感度HPLC分析法の開発と病態モデルマウス尿試料分析への適用2011

    • Author(s)
      轟木堅⼀郎、橋本裕輝、森 俊訓、町田和之、糸山美紀、巴山 忠、吉田秀幸、能田 均、中島 学、山口政俊
    • Organizer
      第9回次世代を担う若手のためのフィジカル・ファーマフォーラム(PPF2011)
    • Place of Presentation
      箱根
    • Year and Date
      2011年9月13日
  • [Presentation] Fluorous Scavenging Derivatization(FSD)法による病態モデルマウス尿中有機酸の蛍光誘導体化-HPLC 分析2011

    • Author(s)
      森 俊訓、橋本裕輝、轟木堅一郎、町田和之、糸山美紀、巴山忠、吉田秀幸、能田均、中島学、山口政俊
    • Organizer
      第48回化学関連支部合同九州大会
    • Place of Presentation
      北九州
    • Year and Date
      2011年7月9日
  • [Presentation] フルオラス誘導体化-オンライン濃縮-蛍光検出法による自然蛍光性カルボン酸の高選択的LC分析2011

    • Author(s)
      山下大貴、坂口洋平、池永純、吉田秀幸、糸山美紀、巴山忠、轟木堅一郎、能田均、山口政俊
    • Organizer
      第48回化学関連支部合同九州大会
    • Place of Presentation
      北九州
    • Year and Date
      2011年7月9日
  • [Presentation] フルオラス誘導体化-LC-MS/MS 法によるシアル酸関連化合物の高感度かつ高選択的分析(4) 糖鎖性腫瘍マーカーへの適用2011

    • Author(s)
      坂口洋平、巴山忠、吉田秀幸、糸山美紀、轟木堅一郎、能田均、山口政俊
    • Organizer
      第48回化学関連支部合同九州大会
    • Place of Presentation
      北九州
    • Year and Date
      2011年7月9日
  • [Presentation] 糖タンパク質中N型糖鎖の高感度キャピラリー電気泳動分析2011

    • Author(s)
      井尻聡一郎,轟木堅一郎,吉田秀幸,吉武尚,能田均,山口政俊
    • Organizer
      第18回クロマトグラフィーシンポジウム
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      2011年6月5日
  • [Presentation] ペンタフルオロフェニル構造を用いる分離指向性誘導体化法の開発2011

    • Author(s)
      川見祐介、坂口洋平、吉田秀幸、巴山忠、糸山美紀、轟木堅一郎、能田均、山口政俊
    • Organizer
      第18回クロマトグラフィーシンポジウム
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      2011年6月5日
  • [Presentation] 分析化学トピックス3点盛り2011

    • Author(s)
      轟木堅一郎
    • Organizer
      第24回九州分析化学若手の会春の講演会(招待講演)
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      2011年5月28日
  • [Presentation] Fluorous Derivatization Combined with LC-MS/MS: Matrix Effect-Free Method for the determination of Biogenic Amines2011

    • Author(s)
      Tadashi Hayama, Ryoko Abe, Rika Kuroki, Miki Itoyama, Kenichiro Todoroki, Hideyuki Yoshida, Hitoshi Nohta, Masatoshi Yamaguchi
    • Organizer
      IUPAC International Congress on Analytical Sciences 2011
    • Place of Presentation
      Kyoto
    • Year and Date
      2011年5月23日
  • [Presentation] Analysis of Sialo-Sugar Chains Using Fluorous Derivatization Followed by Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry2011

    • Author(s)
      Yohei Sakaguchi, Tadashi Hayama, Hideyuki Yoshida, Miki Itoyama, Kenichiro Todoroki, Hitoshi Nohta, Masatoshi Yamaguchi
    • Organizer
      IUPAC International Congress on Analytical Sciences 2011
    • Place of Presentation
      Kyoto
    • Year and Date
      2011年5月23日
  • [Presentation] Fluorous Scavenging Derivatization による高極性有機酸の蛍光誘導体化-超高速LC 分析2011

    • Author(s)
      轟木堅一郎、閔 俊哲、中島 学、豊岡利正
    • Organizer
      フルオラス科学研究会第4回シンポジウム
    • Place of Presentation
      大阪
    • Year and Date
      2011年10月7日
  • [Presentation] UPLC-TOF-MSを用いたヒト毛髪中遊離D-アミノ酸の分析2011

    • Author(s)
      閔 俊哲、保坂大樹、諸田有佳、轟木堅一郎、豊岡利正
    • Organizer
      第22回クロマトグラフィー科学会議
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2011年10月21日
  • [Presentation] 生体内光学活性カルボン酸の誘導体化LC-MS/MS分析2011

    • Author(s)
      筒井陽仁、藤井慎也、閔 俊哲、轟木堅一郎、豊岡利正
    • Organizer
      第22回クロマトグラフィー科学会議
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2011年10月21日
  • [Presentation] Determination of DL-amino acids, derivatized with R(-)-DBD-PyNCS, in nail of diabetic patients by UPLC-ESI-TOF-MS2011

    • Author(s)
      Jun Zhe Min, Suguru Hatanaka, Tatsuya Higashi, Kenichiro Todoroki, Toshimasa Toyo’oka
    • Organizer
      37th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques (HPLC 2011)
    • Place of Presentation
      Dalian, China
    • Year and Date
      2011年10月11日
  • [Presentation] Fluorous Scavenging Derivatization による高極性有機酸の蛍光誘導体化-超高速LC 分析法の開発2011

    • Author(s)
      轟木堅一郎,閔俊哲,中島学,豊岡利正
    • Organizer
      第22回クロマトグラフィー科学会議
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2011-10-22

URL: 

Published: 2013-07-10  

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