2012 Fiscal Year Research-status Report
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23790122
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| Research Institution | 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所) |
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Principal Investigator |
近藤 嘉高 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究員 (20507397)
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| Keywords | 代謝 / 生化学 / 酵素 / 動物 / ペントースリン酸経路 / グルコン酸キナーゼ |
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| Research Abstract |
ペントースリン酸経路は、グルコース6-リン酸をグルコノラクトン6-リン酸、グルコン酸6-リン酸を経て、グリセルアルデヒド3-リン酸に代謝し、NADPHおよび核酸原料の供給を担う。細菌類では、グルコースからグルコノラクトン、グルコン酸を経て、グルコン酸6-リン酸に至る副経路が存在する。しかし、動物において副経路が存在するかどうかは不明である。本研究では、ヒトおよびマウスにおいてグルコン酸をグルコン酸6-リン酸にリン酸化するグルコン酸キナーゼを同定、酵素学的性質を解析した。
NCBIのBLAST検索の結果、細菌Pseudomonas putida KT2440におけるグルコン酸キナーゼ遺伝子のアミノ酸配列は、ヒトおよびマウスにおける候補遺伝子（GenBank accession no.NM_001001551およびNM_198004）のアミノ酸配列とそれぞれ70%および69%の相同性を示した。候補遺伝子は、ヒトおよびマウスの肝臓からmRNAを抽出後、cDNAライブラリーよりクローニングした。N末端に6×Hisを融合した組換えタンパク質は、候補遺伝子をpColdIIベクターに組換えて大腸菌に形質転換した後、15℃で24時間培養して大量発現させた。可溶性分画に発現が認められたので、Ni-NTA agaroseカラムおよびDEAE-Sephacelカラムを用いて純度95%以上に精製した。精製したヒトおよびマウスの6×His融合組換えタンパク質は、グルコン酸キナーゼ活性が認められた。さらに、ヒトおよびマウスの6×His融合組換えタンパク質を抗原としてウサギに免疫した後、抗血清を得た。ウェスタンブロット法による解析の結果、各抗血清は、ヒトおよびマウスの6×His融合組換えタンパク質と反応することが明らかとなった。
以上の結果から、動物におけるペントースリン酸副経路の存在が強く示唆される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ヒトおよびマウスのグルコン酸キナーゼ組換えタンパク質の発現誘導および可溶化、精製の条件検討に当初の予想より時間を要したが、高純度の精製タンパク質を得ることに成功した。また、同組換えタンパク質を用いてウサギに免疫、ポリクローナル抗体を得た。精製組換えタンパク質および抗グルコン酸キナーゼ抗体は、次年度の解析に必須のツールであることから、今後解析が進むと期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
RT-PCR法およびウェスタンブロット法により、ヒトおよびマウスにおけるグルコン酸キナーゼの発現臓器を検討する。また、免疫組織化学染色により発現部位も調べる。
代謝におけるグルコン酸キナーゼの生理的役割を明らかにするため、培養細胞にグルコン酸キナーゼ遺伝子に対するsiRNAを導入したノックダウン細胞および過剰発現細胞を作製する。ペントースリン酸経路および副経路の各酵素の発現量はリアルタイムPCR法を用いて、細胞内NADPH濃度はHPLC法を用いて測定し、グルコン酸キナーゼの変動が代謝系に及ぼす影響を明らかにする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
HPLCのカラムやバイアル、プライマー、ポリメラーゼ、制限酵素、ベクター、siRNA導入及びトランスフェクションの試薬、リアルタイムPCRプローブや測定キット、培養細胞、培地、その他チップやチューブ等消耗品の費用が必要となる。また、本研究の成果を学会発表するための旅費、論文発表するための掲載料が必要となる。
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[Journal Article] A significant relationship between plasma vitamin C concentration and physical performance among Japanese elderly women : Comparison in healthy Japanese subjects.2012
Author(s)
Saito K., Yokoyama T., Yoshida H., Kim H., Shimada H., Yoshida Y., Iwasa H., Shimizu Y., Kondo Y., Handa S., Maruyama N., Ishigami A. and Suzuki T.
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Journal Title
J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci.
Volume: 67(3)
Pages: 295-301
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Differential effect of vitamin C deficiency on the pathogenesis of diabetic nephropathy.2012
Author(s)
Okada H., Senmaru T., Kondo Y., Ishigami A., Obayashi H., Asano M., Yamazaki M., Fukui M., Hasegawa G., Nakamura N.
Organizer
72th annual meeting and scientific sessions of American Diabetes Association
Place of Presentation
SanDiego, USA
Year and Date
20120608-20120612
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