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2011 Fiscal Year Research-status Report

カルモジュリンをリンクさせた変異体を用いたL型Caチャネルの活性調節機構の解析

Research Project

Project/Area Number 23790251
Research InstitutionKagoshima University

Principal Investigator

蓑部 悦子  鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (00448581)

Project Period (FY) 2011-04-28 – 2013-03-31
Keywordsカルモジュリン / カルシウムチャネル / Cav1.2 / パッチクランプ法 / inside-out / ATP / カルシウムイオン / 細胞内カルシウム
Research Abstract

L型Caチャネル(Cav1.2)のC末端部切断チャネル(Cav1.2Δ)にグリシン鎖を介してカルモジュリン(CaM)を融合させたチャネル変異体(Cav1.2ΔCaM)にパッチクランプ法を適用し、CaMによるCaチャネル活性の調節機構を調べた。L型Caチャネルには、細胞内Caイオン濃度に依存した促通(CDF: Ca2+-dependent facilitation)と不活性化(CDI: Ca2+-dependent inactivation)がありCaMがその制御に不可欠である。これについては、Cav1.2ΔCaMを用いた実験からも明らかであるが、分子機序についての十分な説明はなされていない。さらに、Inside-outによる記録では、Caチャネルの活性が細胞内Caイオン濃度依存的に調節されると同時に、CaM濃度に依存することが示唆された。よって、Caイオン濃度に加え、CaM濃度とチャネル活性の関係を明らかにすることは重要である。 これまでの研究からCaチャネルの活性維持にはCaMとATPが必須であり、その作用はリン酸化を介さないことが報告されている。今回、ATPに換えてフォスファターゼ阻害剤であるオカダ酸をCaMと共にチャネルに付加したところ、ATP + CaMと同様にチャネルの活性作用を示した。オカダ酸 + ATP + CaMでも同様な作用を示し、チャネル活性に有意差はなかった。Cav1.2ΔCaMでは、ATPの効果をオカダ酸で置き換えることはできなかった。このことから、ATPがチャネルの脱リン酸化を抑制することが示唆された。また、プロテインフォスファターゼ(PP2AやPP2B)の結合部位はチャネルC末端遠位部にあり、その配列を持たないCav1.2ΔCaMでは、脱リン酸化による影響が低いことが示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでの結果から、Cav1.2ΔCaMのCaチャネルC末端とCaMを繋ぐグリシン鎖の長さに依存してCaMの自由度が変わることが、CaMによるチャネルの調節機構を本来の形から曲げてしまうことが示唆された。そこで、グリシン鎖の長さを、チャネル活性に違いがみられた48残基と72残基の間の60残基にして、野生型チャネルと同様なCaM応答を示すよう調整することを計画し、チャネル変異体を作製した。 また、チャネルC末端部によるチャネル不活性化を検討するため、C末端ペプチドの作製も進行中である。ATPの作用とチャネルC末端遠位部との関係については、オカダ酸を用いた実験で検討中である。 成果は、学会で発表した。

Strategy for Future Research Activity

グリシン鎖の長さを60残基に調節した変異体のCaM濃度-チャネル活性の関係を調べ、野生型や他の変異体と比較する。これらの検討により、2分子のCaMによるチャネル調節という我々の仮説の妥当性を評価する。一般的な仮説では、チャネルC末端に結合した1分子のCaMが細胞内Ca2+濃度に依存して構造変化をおこすことがチャネル不活性化につながると考えられている。また、促通現象についてはCaM依存性キナーゼII(CaMKII)による直接作用やリン酸化が関与することが報告されている。これらの解明のために、Cav1.2ΔCaMにアミノ酸変異を導入し、仮説の検討を行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

電気生理学実験に必要な試薬、電子媒体電気部品などの消耗品への使用を予定している。また、チャネルDNAの発現系を用いて実験を行うため、培養細胞の維持(培養室の管理、試薬など)に使用する。 Caチャネルのアミノ酸変異体の作製、進行中のチャネルC末端遠位部ペプチドの作製を行うための遺伝子工学実験用試薬、タンパク質精製用の試薬などの消耗品への使用を予定している。  成果発表ため、学会参加にかかる費用(旅費など)、また、英語論文校正費、別刷り代などを予定している。

  • Research Products

    (12 results)

All 2012 2011 Other

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (10 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Calpastatin domain L is a partial agonist of the calmodulin-binding site for channel activation in Cav1.2 Ca2+ channels.2011

    • Author(s)
      Etsuko Minobe, Hadhimulya Asmara, Zahangir A. Saud, Masaki Kameyama
    • Journal Title

      The journal of biochemistry

      Volume: 286 Pages: 39013-39022

    • DOI

      10.1074/jbc.M111.242248

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Competitive regulation by calpastatin and calmodulin on Cav1.2 Ca2+ channel activity.2012

    • Author(s)
      Etsuko Minob, Hadimulya Asmara, Zahangir A. Saud, Masaki Kameyama
    • Organizer
      日本生理学会大会
    • Place of Presentation
      長野
    • Year and Date
      2012.3.29-31
  • [Presentation] Multiple functional phosphorylation sites of protein kinase A in the C-terminal tail of Cav1.2 channel.2012

    • Author(s)
      Etsuko Minobe, Sachiko Maeda, Jianjun Xu, Li-Ying Hao, Rui Feng, Kazuto Yazawa, Asako Kameyama, Masaki Kameyama
    • Organizer
      日本生理学会大会
    • Place of Presentation
      長野
    • Year and Date
      2012.3.29-31
  • [Presentation] Mechanism underlying the modulation of L-type Ca2+ vhannel by hydrogen peroxide in guinea-pig ventriculafr myocytes.2012

    • Author(s)
      Lei Yang, Jianjun Xu, Etuko Minobe, Rui Feng, Asako Kameyama, Kazuto Yazawa, Masaki Kameyama
    • Organizer
      日本生理学会大会
    • Place of Presentation
      長野
    • Year and Date
      2012.3.29-31
  • [Presentation] 宇宙放射線および微小重力がヒト神経細胞に及ぼす影響2011

    • Author(s)
      馬嶋 秀行、犬童 寛子、富田 和男、石岡 憲昭、鈴木 ひろみ、島津 徹、矢野 幸子、谷垣 文章、永松 愛子、桝田 大輔、今岡 朝世,柴田 恭子,安孫子 宜光、蓑部 悦子、亀山 正樹
    • Organizer
      宇宙生物科学会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      20111030-1101
  • [Presentation] Facilitation of L-type Ca2+ channels by hydrogen peroxide in guinea-pig ventricular myocytes.2011

    • Author(s)
      Lei Yang, Jianjun Xu, Etsuko Minobe, Rei Feng, Asako Kameyama, Kazuto Yazawa, Masaki Kameyama
    • Organizer
      The joint conference of SFRR-Asia, ASMRM and J-mit
    • Place of Presentation
      鹿児島
    • Year and Date
      2011.8.30-9.4
  • [Presentation] 宇宙放射線および微重力が哺乳細胞に及ぼす影響2011

    • Author(s)
      犬童寛子、石岡憲昭、鈴木ひろみ、島津徹、矢野幸子、谷垣文章、舛田大輔、蓑部悦子、亀山正樹、馬嶋秀行
    • Organizer
      日本酸化ストレス学会学術集会
    • Place of Presentation
      北海道
    • Year and Date
      2011.7.2-3
  • [Presentation] ヒト神経様SK-N-SH細胞の国際宇宙ステーションに滞在における影響2011

    • Author(s)
      馬嶋秀行、犬童寛子、宮田和男、石岡憲昭、鈴木ひろみ、島津徹、矢野幸子、谷垣文章、永松愛子、舛田大輔、今岡朝世、柴田恭子、安孫子宜光、蓑部悦子、亀山正樹
    • Organizer
      国際放射線神経生物学会大会
    • Place of Presentation
      群馬
    • Year and Date
      2011.12.3
  • [Presentation] カルパスタチンのL領域は、Cav1.2Ca2+チャネルのカルモジュリンによる活性化部位の部分アゴニストとして働く2011

    • Author(s)
      蓑部悦子、Hadhimulya Asmara、Zahangir A. Saud、亀山正樹
    • Organizer
      生理学研究所研究会
    • Place of Presentation
      愛知
    • Year and Date
      2011.11.29-30
  • [Presentation] Effects of 14 and 28 days exposure of human neuro cells in Space; Neuro Rad Experiments.2011

    • Author(s)
      Hiroko P. Indo, Noriaki Ishioka, Hiromi Suzuki, Toru Shimazu, Sachiko Yano, Fumiaki Tanigaki, Aiko Nagamatsu, Daisuke Masuda, Etsuko Minobe, Masaki Kameyama, Hideyuki J. Majima
    • Organizer
      SFRBM's Annual Meeting
    • Place of Presentation
      Atlanta
    • Year and Date
      2011.11.16-20
  • [Presentation] CaMKII-dependent and independent facilitation of L-type Ca2+ channels by hydrogen peroxide in guinea-pig ventricular myocytes.2011

    • Author(s)
      Lei Yang, Jianjun Xu, Etsuko Minobe, Rui Feng, Asako Kameyama, Kazuto Yazawa, Masaki Kameyama
    • Organizer
      西日本生理学会
    • Place of Presentation
      佐賀
    • Year and Date
      2011.10.14-15
  • [Remarks]

    • URL

      http://www.kufm.kagoshima-u.ac.jp/~physiol2/

URL: 

Published: 2013-07-10  

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