Ｉｎ ｖｉｖｏナノイメージングによる心疾患の病態解析

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23790254
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 照井 貴子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (10366247)
• Keywords: 分子・細胞生理学

Research Abstract

本研究では、近年急速に発展している分子イメージング技術を駆使し、心臓の心筋線維の最小ユニットであるサルコメアの収縮動態をin vivoで高い時間・空間分解能でライブイメージングできる技術を開発することで、生体内の心筋収縮・弛緩をナノレベルで可視化し、心筋の収縮・弛緩の分子メカニズムの解明をねらう。
生命科学・医学研究において生体内の様々な制御メカニズムを解明するためには、in vitro のみならずin vivoでの分子メカニズムの解明が待たれるが、心筋研究においては、心臓自体が常に拍動し続けている臓器であるため、その技術的な難しさからin vivo研究はほとんど行われていない。
心筋の収縮・弛緩のメカニズムや心不全の病態メカニズムを明らかにするためには、特定の分子の動きを動物個体内で観察する必要がある。この考えに基づき、明るい蛍光（ローダミンの約1,000倍）を長時間（最大約1時間）発する量子ドット（Qdot）や蛍光色素、遺伝子組み換えウィルスベクターを用いて蛍光タンパク質を発現させることにより心筋サルコメアのイメージング（Z線イメージング）を高時間（～2 ms）・空間（～5 nm）分解能で行う。
平成23年度では、in-vitroからin-vivoイメージングへ研究を進めていく上で、非常に重要なex-vivoイメージング装置を開発し、本研究をより実質的かつ装置系に段階性を持たせ、平成24・25年度は、ex-vivoイメージング装置を実際に使用し、擬似生体内での心筋サルコメアの収縮・弛緩動態をイメージング可能となった。ex-vivoイメージング装置を用いて酸塩基平衡やイオン濃度なども詳細に測定しながら、心筋の収縮様式の詳細、また、Ca2+イオン濃度変化のない状態での心筋細胞の動態についても検討を行う。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

ex vivo心筋ナノイメージング技術の開発：
心筋の収縮弛緩の分子メカニズムを明らかにするためには、特定の分子の動きを動物個体内で観察する必要がある。これまでに得られたナノイメージング技術を小動物（ラット、マウス）in vivoに応用し、生体内での心筋収縮・弛緩のメカニズムの解析を行う予定であるが、その前段階として、ラット摘出心を用いてランゲンドルフ還流下に顕微鏡観察ができるex-vivoイメージング装置を構築した。
ex-vivo イメージング装置を用いた心筋細胞動態の観察
一般的に、心臓の心筋収縮自体は、いわゆる心臓のペースメーカー（洞結節）からの心拍により約１秒に１回の頻度で活動電位が生じ、心臓全体に伝搬する。その伝搬により心筋細胞内のCa2+イオン濃度が急激に上昇し、心筋細胞が収縮するといわれている。ex-vivoイメージング装置を用いることにより、その収縮様式について、詳細に観察することが可能となった。また、Ca2+イオン濃度変化のない状態での心筋細胞の動態についても検討できることが示唆された。除膜心筋収縮系サルコメアは，Ca2+濃度一定の条件下で自発的に振動し（SPOC:Spontaneous Oscillatory Contraction）、その振動数は動物種に固有の心拍数と相関することが報告されている。また、心筋細胞に抗αアクチニン抗体-量子ドット複合体を導入することによりZ線をイメージングすることが可能であり、生理的な電気刺激頻度においてSPOCに類似した鋸波の振動波形が出現することが判明している。細胞レベルで確認されている心筋サルコメアの自励振動（SPOC）が、臓器レベルで確認されるかどうか、今後追加構築するex-vivoイメージング装置を用いて検討する。

Strategy for Future Research Activity

ex-vivoイメージング装置の改良・使途拡大
in-vivoイメージングすなわち生きた個体では、コントロール困難なパラメータ（血中Ca2+濃度、ペーシングによる心拍数変調etc...）があるほか、蛍光物質などは生体内に投与しては悪影響を来しうるため、これらの系を用いた研究は困難を極める。この点に関し、擬似生体内条件ではあるが、ex-vivoイメージング装置を用いて研究することで、先述のあらゆる実験系を用いた新たな収縮・弛緩のメカニズム解析が可能になると考えられる。また、in-vivoイメージングでは可能な限り顕微鏡観察困難となりうる因子（呼吸・血液など）を省いて観察できるため、心筋サルコメアに特化して観察することが可能である。よって、心筋の収縮・弛緩のメカニズム解明において、必要かつ重要な装置系と考え、改良および使途拡大を図りたいと考えている。今後は、ex-vivo イメージング装置に酸塩基平衡やイオン濃度を測定できる系を加え、より詳細な収縮動態の解明を行っていく予定である。
ex-vivoおよびin-vivoイメージング装置を用いて、生体内の心臓収縮期・拡張期におけるリアルタイムサルコメア動態の解明、心筋サルコメアの収縮・弛緩以外の詳細な動態の解明およびFrank-Starlingの心臓法則と筋長効果の相互関係の解明を目指す。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

当初の実験予定にex vivo心筋ナノイメージングを加え、その実験装置の開発・改良を行っている。ex vivoイメージングの測定系および実験装置としての精度を上げるため、酸塩基平衡などの測定系を実験装置に追加する予定であるが、その測定系の選出に難渋しているため
ex-vivo イメージング装置を用いた心筋細胞動態の観察：ex-vivoイメージング装置を使用し、生体内という条件にかなり近い形での心筋サルコメアの収縮・弛緩動態をイメージング可能となった。除膜心筋収縮系サルコメアは，Ca2+濃度一定の条件下で自発的に振動する（SPOC）。細胞レベルで確認されている心筋サルコメアの自励振動（SPOC）が、臓器レベルで確認されるかどうか、ex-vivoイメージング装置を用いて検討する。今後、2光路系を構築することにより細胞内のCa2+濃度とZ線を同時にイメージングし、新たなイオン濃度などもコントロールできる系を用いることにより、Ca2+濃度変化に依存しない心筋細胞動態、サルコメア長変化が生じるか否かを詳細に調べ、心筋収縮における自励振動（SPOC）の存在・意義を明らかにする。