2011 Fiscal Year Research-status Report
DMドメイン型転写因子を介した体細胞レベルで生じる性差の解析
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23790258
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Research Institution | Ritsumeikan University |
Principal Investigator |
井上 英樹 立命館大学, 生命科学部, 助教 (20550156)
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Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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Keywords | DMドメイン型転写因子 / 性差 / 線虫 |
Research Abstract |
線虫においてDMドメイン型転写因子MAB-3がGATA転写因子、ELT-2標的遺伝子の転写抑制を介して酸化ストレス耐性の性差に関与することをこれまでに見出した。そこで、MAB-3がどのようにELT-2を抑制するかを明らかにするため最初にMAB-3とELT-2の相互作用をin vitroで検討した。その結果、MAB-3とELT-2の相互作用はみられなかった。続いて、MAB-3がELT-2の転写機能を抑制する機構を明らかにするために、これまでに同定したMAB-3およびELT-2の標的遺伝子のプロモーターに着目し、線虫ゲノムDNAよりmtl-1, mrp-5, F28A12.4各遺伝子のプロモーターを単離し、GFPをレポーター遺伝子とするレポータープラスミドを作成した。同時に、これらプロモーターのMAB-3結合部位に変異を導入した変異型のレポータープラスミドを作成した。これらレポーターを線虫に導入し、トランスジェニック個体を得た。続く解析によりMAB-3によるELT-2転写機能の抑制機構を明らかにする。 哺乳動物に保存されるDMRT遺伝子は7種類報告されている。これらの発現について体細胞レベルで性差がみられるかを、雌雄マウスの臓器における各DMRT遺伝子の発現をRT-PCRにより解析した。その結果、肝臓、脳等でDMRT遺伝子は雌雄ともに発現せず、あるいは雌雄での発現に差はみられなかった。いっぽう心臓においてDMRT1, DMRT2, DMRT3各遺伝子の発現が雄でのみ観察された。また、線虫でレポーター遺伝子として用いることが可能であるmtl-1の哺乳動物ホモログであるMT1の発現に性差が生じるかを、雌雄マウスの各臓器を用いて比較した。その結果、複数の臓器でその発現に性差が確認された。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は研究計画に沿って進めており、マウスを用いた研究においては特に順調に研究計画が遂行できている。線虫を用いた研究において、MAB-3とELT-2間の相互作用を解析するに当たり、共免疫沈降実験において非特異的なバンドによる結果の解釈に時間を若干取られたことにより、わずかに達成できていないが、次年度に十分達成可能であると考えられる。
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Strategy for Future Research Activity |
線虫においては、レポータープラスミドを導入したトランスジェニック線虫を用いたプロモーターの転写活性解析を用いてMAB-3によるELT-2の制御機構を明らかにする。同時にゲルシフトアッセイ等によるMAB-3、およびELT-2のプロモーター領域への結合実験を行う。また、平成23年度中の研究において、MAB-3とELT-2の直接の相互作用が確認されなかったため、相互作用を仲介する因子が存在する可能性を考え、MAB-3と相互作用する因子を同定するためのスクリーニングを進めている。哺乳動物においては、DMRT発現の性差がみられた組織から初代培養細胞を作成し、培養した細胞のストレス耐性等を調べる。また、各DMRT遺伝子についてcDNAを単離し、過剰発現実験を行うとともにDMRT遺伝子のsiRNAを作成し、ノックダウン実験を行う。これにより初代培養細胞におけるDMRT遺伝子のストレス耐性への関与を検証する。DMRT遺伝子をクローニングすると同時に、哺乳動物GATA転写因子のクローニングを行い、哺乳動物におけるDMRTとGATAの関係の解析に用いる。また、DMRT遺伝子の発現が増加しているヒトのがん由来の培養細胞株が存在する。この細胞はエストロゲン依存的に増殖することが報告されている。哺乳動物の性は性ホルモンにより規定されているが、体細胞レベルで性差を決定する因子等は明らかではない。そこで、性ホルモンと体細胞レベルの性差の関係を明らかにするため、初代培養細胞を用いた研究と並行させて解析を行う。
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Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
線虫の飼育、およびマウスの購入、飼育(培地、プラスチック培養皿、餌、ケージ等)に研究経費を使用するとともに線虫およびマウスを用いた実験に係る器具および消耗品(酵素類、オリゴプライマー、抗体等)の購入を行う。また、国内・国外学会の出張旅費に使用する計画である。
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