2011 Fiscal Year Research-status Report
化学物質評価のためのヒト型Ｐ４５０を持つメダカの作製
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23790673
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
吉岡 範幸 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (70365229)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | CYP1A |
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| Research Abstract |
公開されているメダカゲノム情報から得られた配列をもとにRT-PCRを行い、メダカCYP1A1遺伝子をクローニングした。シーケンスにより塩基配列、およびエキソン・イントロン境界を確定し、同時に、スプライシングバリアントがないことを確認した。C末50～60残基手前には、Phe-X-X-Gly-X-Arg/His-X-Cys-X-Glyという共通配列があり、ヘムの結合に関与している。メダカCYP1A1遺伝子のC末付近に、Phe-Ser-Leu-Gly-Lys-Arg-Arg-Cys-Ile-Glyという配列を持つ。したがって、この共通配列をコードする部分より上流のエキソン部分をターゲットに、メダカTILLINGライブラリーの6,000サンプルのゲノムDNAストックをPCR増幅した。各PCR産物をシーケンスし、スプライス部位の変異（イントロンの変異だが、スプライシングに必要なGT-AG規則が破壊されているもの）を確認することができた。人工授精を行って、CYP1A遺伝子が破壊されているメダカを得た。実際にスプライシングの異常が起きているかRT-PCRを行った。変異体において第３エクソンのスプライシングが起きていいないことを確認した。次に正常蛋白質合成の有無をウェスタン解析により調べた結果、変異体において正常蛋白質は合成されていないことを確認した。さらにはEROD活性テストをおこない、代謝活性を調べたが活性が無いことがわかった。以上により得られた変異体はCYP1A遺伝子を完全にノックアウトしていることを確認できた。次にCYP１A1遺伝子以外にも多数点変異を含んでいるので、野生型に戻し交配を４回行い、これらを取り除いた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究で肝となるCYP1Aノックアウトメダカの作成が完了した。作成したノックアウトメダカは野生株と比較してベンゾピレンや3-メチルコラントレンといった多環芳香族炭化水素により低濃度で毒性を発現し、高感受性であることが解った。これら多環芳香族炭化水素がノックアウトメダカでは代謝されにくいことも確認できた。残りはトランスジェニックメダカ作成し、同様に化学物質の曝露とその定量、変異原性を調べるだけであり、順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
マイクロインジェクションにより、ヒト由来のCYP1A1遺伝子のBAC断片をCYP1A遺伝子破壊メダカの受精卵に戻し、トランスジェニックメダカを作製する。作製したトランスジェニックメダカのCYP1A1の発現と発現量をリアルタイムPCR、ウェスタンブロットで確認する。さらにCYP1A1で代謝されるベンゾピレンを曝露し、導入したCYP1A1がヒトと同様に代謝するか検証する。好発癌の系統であるp５３遺伝子破壊メダカと交配することにより、さらに鋭敏に変異原性が確認できるか調べる。曝露物質には同様にベンゾピレンを用いる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果であり、翌年度の消耗品購入に充てる予定である。次年度の研究費は大部分を実験試薬、実験器具といった消耗物品費に充てる予定である。それ以外では研究結果発表のための旅費、論文投稿費、報告書作成費に充てる予定である。
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