2012 Fiscal Year Annual Research Report
次世代シーケンサを用いたＨＣＶ感染に関連する宿主遺伝子・シグナル経路の包括的解析
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23790778
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
櫻井 幸 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 医員 (70547455)
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| Keywords | C型肝炎ウイルス / 包括的解析 / pathway解析 / 宿主・ウイルス相互作用 / 自然免疫 |
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| Research Abstract |
平成２３-２４年度の研究計画として申請者は下記の研究を行い、以下の実績を得た。
(1) 蛍光蛋白発現レプリコン細胞の構築、DNAマイクロアレイ解析：1b, 2a-replicon高発現細胞、cured-1b, -2a細胞、親株Huh7細胞の各々からtotal RNAを抽出後、Gene Chip (Affymetrix)を用いたマイクロアレー解析、および階層的クラスター解析を行った。その結果、1b, 2a-Yeo replicon高発現細胞では脂質関連経路の発現亢進を認めた。
(2) HCV-NS4B truncated plasmidの作成、発現解析、HCV-NS4BとCardif, STINGの免疫染色：構築した欠失NS4BプラスミドをCardifまたはRIG-I発現プラスミド共にHuh7細胞に強制発現させ、IFN発現系抑制の責任分子、及びそのドメイン、相互作用する宿主蛋白を解析した。NS4BのN末端側にINF-βプロモーター・リポーターの活性と関連する部位が存在することを明らかにした。HCV-NS4BとCardif, STINGの相互作用を確認するため、それぞれの局在と小胞体膜との位置関係を解析するべく免疫蛍光染色を行ったところ、HCV-NS4BとSTINGが結合することを確認した。
(3) HCV-NS4BとCardifのBiFC assay：生細胞を用いてタンパク質―タンパク質相互作用の時間的・空間的な変化を可視化できるBiFC assayを用いて、HCVNS4BとSTINGの相互作用の解析を目的に、BiFC assayを行った。免疫沈降法との結果も併せ、NS4BとSTINGは直接結合し、STINGを介したIFN発現誘導を抑制していることを示した（Hepatology, 2013）。
(4) HCV増殖に関連する宿主肝細胞のmicro RNA 発現の包括的解析を検証した。
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