誘導多能性幹細胞由来心筋細胞の機能解析および質の検討

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23790877
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 大野 洋平 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (80383884)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2013-03-31
• Keywords: iPS細胞からの心筋分化

Research Abstract

様々なiPS細胞ラインの多能性幹細胞としての生物学的性質の違い、各細胞ラインの心筋細胞への分化効率の違いとその要因を検討し、iPS細胞由来心筋細胞が細胞移植源として適しているかを「安全性」と「質」という二つの側面から評価することを目的としている研究である。各iPS細胞ラインの未分化マーカーの発現量の違いをRT-PCRで確認、心筋細胞へ分化するまで経時的に未分化マーカー・中胚葉・心筋構造蛋白・転写因子などをQT-PCRで確認した。また、各iPS細胞ライン毎に電気生理学的解析を行い、薬剤(β刺激薬やカルシウム拮抗薬)に対する反応の違いを検証した。また、各iPS細胞由来の心筋細胞を回収し、ミトコンドリア法を使用して心筋細胞のみを純化した上で、その細胞生物学的性質を解析している。iPS細胞樹立時に用いた導入因子transgeneの発現の程度を確認してみると、ほぼ心筋細胞のみに純化を行ってもなお、iPS細胞ラインによってはtrangeneの発現が見られた。そのtrangeneの発現量と心筋細胞誘導効率には負の相関を示す傾向が確認された。現在、レトロウィルスを使用しないでiPS細胞を作製したラインなどを使い、心筋細胞誘導効率などを検討している。心筋細胞自体の機能については、transgeneの発現が認められても、活動電位のパターンや、薬剤刺激による拍動頻度についてはライン間による大きな差は認められていない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

iPS細胞より心筋細胞を誘導し、心筋細胞を高純度で精製した後も、一部のiPS細胞由来の心筋細胞では、iPS細胞作製時に使用したtransgeneの発現が検出された。この現象を詳細に解析するために、レトロウイルスを使用しないで作製したiPS細胞およびc-Mycを使用しない3因子導入によるiPS細胞など、様々な条件でのiPS細胞からの心筋細胞誘導を行い、解析を進めており、当初の計画よりやや遅れをとっている状況である。

Strategy for Future Research Activity

iPS細胞由来心筋細胞の性質を解析した後は、実際にその心筋細胞を使用し、心不全モデル(心筋梗塞、高血圧、肺高血圧など)のマウスに移植することで心機能および生命予後の改善が得られるかを検討したいと考えている。具体的には、マウスにおいて心筋梗塞、高血圧、肺高血圧による心不全モデルを作製する。たとえば、心筋梗塞のモデルマウスにおいて、iPS細胞由来心筋細胞を(i)梗塞部に直接注入する、(ii)経静脈的に注入する、ことで心機能および生命予後の改善が得られるか検討する。移植する細胞は後の解析のため、蛍光標識されたものとする。直接、あるいは経静脈的に細胞移植治療を受けたマウスの心臓をIVIS®を用いてlive imagingを行い、さらに免疫組織染色を行い、移植した細胞の組織学的解析を行う。一方で、細胞移植治療を受けたマウスを長期的に観察し、不整脈などが起こらないかをホルター心電図を装着することにより解析する。また、腫瘍形成の有無に関しても確認して、安全性の評価を行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

引き続き、研究を継続するために血清、抗体、物品などにあてるのと、次年度中に主要学術誌への投稿を行いたいと考えているため、外国語論文校閲料や雑誌への投稿料などにあてたいと考えている。

Research Products

• [Presentation] Residual Transgene Expression Of Yamanaka Factors Determine Quality And Differentiation Efficiency Of Cardiomyocytes Derived From Mouse Induced Pluripotent Stem Cell Lines (2012)
  • Author(s): Ohno Y, Yuasa S, Egashira T, Seki T, Hashimoto H, Tohyama S, Kodaira M, Kusumoto D, Hattori F, Yae K, Murata M, Fukuda K
  • Organizer: American College of Cardiology
  • Place of Presentation: シカゴ、アメリカ
  • Year and Date: 2012年3月12日