2012 Fiscal Year Annual Research Report
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23790893
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
榊原 智博 東北大学, 大学病院, 助教 (80422111)
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| Keywords | ピルフェニドン |
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| Research Abstract |
前年度に引き続き、ピルフェニドンの標的分子を同定することを目的に、アフィニティー精製法を用いて、ピルフェニドン標的分子の同定を試みた。培養細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞の細胞質画分と核画分を用いたアフィニティー精製で、ピルフェニドン誘導体―１、２、３（ＰＤ－１、ＰＤ－２、ＰＤ－３）それぞれにピルフェニドン結合タンパク質の候補が検出されたが、繰り返し実験において再現性を得ることができなかった。そこで細胞をかえて、上皮系培養細胞であるＰＣ－９（ヒト肺癌由来）を用い、大量培養したのちに細胞溶解バッファーで、細胞質画分を得た。このタンパク質溶液を用いて、ＰＤ－１でアフィニティー精製を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法でタンパク質を分離し、銀染色で可視化したところ、約４０ｋＤのあたりにバンドが確認され、ピルフェニドン標的分子の候補が確認された。さらにフリーのピルフェニドンを用いた結合競合実験で、ピルフェニドン標的分子の候補と、ＰＤ－１との結合は阻害され、このピルフェニドン標的分子の候補は、真の標的分子である可能性が示唆された。このタンパク質同定のため質量分析を行ったが、タンパク質を十分に濃縮することができず、最終的に同定には至らなかった。その後ＰＣ－９の細胞質画分を用いて繰り返しアフィニティー精製を行ったが、標的分子の同定には至らなかった。ＴＧＦ－βでＡ５４９細胞を刺激し、ピルフェニドンの線維化抑制効果を示した論文が発表されたため、ＴＧＦ－βで刺激された上皮細胞に標的分子が存在すると仮定し、ＴＧＦ－βで刺激されたＡ５４９細胞の細胞質画分を用いて、同様のアフィニティー精製を行った。ＰＤ－１、ＰＤ－２、ＰＤ－３それぞれで実験を行ったが、ピルフェニドンの標的分子の同定には至らなかった。
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