2011 Fiscal Year Research-status Report
プロテオミクスによる脱髄型ギラン・バレー症候群の新規標的分子の同定
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23790976
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
澤井 摂 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10400962)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | ギラン・バレー症候群 / プロテオミクス / 自己抗体 |
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| Research Abstract |
本研究は、プロテオーム解析の手法を用いて、脱髄型ギラン・バレー症候群(GBS)における自己免疫の標的分子を同定し、その病態の解明とそれに基づく新規治療法を開発することを目的とする。これまでの知見から、脱髄型GBSの標的分子は末梢神経ミエリンの構成蛋白ではなく、Schwann細胞外層表面に発現する蛋白であると予想される。そこで、本研究では、Schwannomaの細胞株から蛋白を抽出し、そこから標的分子の探索を行った。これまでの研究では、Schwannoma培養細胞から抽出した蛋白質を2次元電気泳動法で展開し、脱髄型GBS 5症例の患者血清中IgGと免疫反応する抗原候補蛋白質をWestern Blottingにより評価し、反応のみられた抗原蛋白質を、質量分析計とデータベース解析で431個同定した。それらの蛋白質の中から、これまで報告されているその蛋白質の機能、Schwannoma培養細胞内での局在情報、GBS発症に係わる先行感染の起因病原体別の解析から、脱髄型GBSの抗体標的分子を3つの蛋白質にまで絞り込み、これらの抗原を用いて、脱髄型GBS患者血清中IgGとの反応を検証した。その結果、脱髄型GBS 22症例中7症例（32%）で抗体陽性となる蛋白質を認めた。この蛋白質に対する自己抗体は、正常対照や軸索型GBSではほとんど認めないことから、脱髄型GBSの病態に、特異的に関連する可能性が示唆された。患者血清中IgGとこの抗原蛋白質の結合部位のアミノ酸配列が分かれば、より高感度に自己抗体の存在を診断できるELISAキットの作製や、動物に免疫して脱髄型GBSモデル動物を作製することにつながる可能性があるため、現在、断片化した蛋白質を作製中であり、これらを抗原として、患者血清とWestern Blottingすることで、血清中IgGの標的分子を探索する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、Schwannoma培養細胞から抽出した蛋白質を2次元電気泳動法で展開し、脱髄型GBSの患者血清中IgGと免疫反応する抗原をWestern Blottingで評価し、反応のみられた抗原蛋白質を質量分析計とデータベース解析で同定することで、脱髄型GBSにおける有望な免疫標的分子の候補が判明した。このことから研究はおおむね順調に進んでいるが、患者血清中IgGとその分子の結合部位（アミノ酸配列）の解析について、当初の予定ではクリーブランド法を用いる予定であったが、抗原を蛋白質分解酵素と混ぜて泳動すると、抗原の断片化が短時間で進行してしまい解析が困難であった。そのため、ベクターを用い細胞にトランスフェクションすることで、蛋白質のN末側、中間部、C末側の3分割に断片化した抗原蛋白質を作製し、患者血清中IgGと反応させ、標的部位を解析することにした。現在、抗原作成中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在作成中の断片化した合成抗原蛋白質を用い、Western Blottingにより患者血清中IgGとの反応をみることで、抗原蛋白質における抗体結合部位のアミノ酸配列を解析し、その合成ペプチドを用いて、ELISAキットなどの自己抗体測定系の作製と、脱髄型GBSの動物モデルの作製を試みる。動物モデル作製後は、神経伝導検査による脱髄型末梢神経障害の評価と組織学的検討などを行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
断片化抗原蛋白質の作製のための試薬と、動物モデル作製のために用いる。動物モデルはラットを予定している。また、動物モデル作製後の評価のために行う神経伝導検査や組織学的検討に消耗品や試薬を購入する予定である。
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