2011 Fiscal Year Research-status Report
ＧＤＰ型Ｒａｂ２７ａエフェクター間のクロストークによる顆粒膜動態制御の解明
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23791039
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
木村 俊秀 大分大学, 医学部, 准教授 (60404373)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | 低分子量Gタンパク質 / インスリン / 膵B細胞 / エンドサイトーシス / Rab27a / 糖尿病 / IQGAP1 / coronin |
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| Research Abstract |
申請者は、これまで不活性型と考えられてきたGDP型Rab27aに結合する分子としてcoronin3を同定し、その結合が膵B細胞でエンドサイトーシスを制御することを示した。本研究は、申請者がGDP型Rab27a結合候補タンパク質として最近同定したIQGAP1の機能を、分子レベルで明らかにすることを目的としている。本年度は、GDP型Rab27aとIQGAP1の結合様式を生化学的手法で調べた。 まず、IQGAP1の精製タンパク質と抗体を作製した。次に、免疫沈降法とpull down assayにより、IQGAP1がGDP型Rab27aと細胞内で複合体を形成すると共に、その結合が直接であることを示した。また、精製タンパク質を用いた結合実験により解離定数(Kd)を算出し、IQGAP1とGDP型Rab27aとの結合が特異的であることを示した。次に、IQGAP1のドメイン構造を指標に様々なフラグメントを作製し、GDP型Rab27a結合部位を同定した。さらに、同定した結合部位をもとにドミナントネガティブ/アクティブ変異体の作製を行った。また、膵B細胞やインスリン分泌細胞株であるMIN6細胞を免疫染色し、IQGAP1がRab27aと共局在していることを明らかにした。 以上の結果より、GDP型Rab27aとIQGAP1の結合様式が明らかになった。本研究成果は、次年度以降に行うIQGAP1の活性制御機構やIQGAP1によるエンドサイトーシスの制御機構を理解する上で極めて重要であると共に、GDP型Gタンパク質によるシグナリングという意味からも基礎生物学上重要な知見である。従って、本年度の研究計画は、当初の計画以上に進展していると考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究では、GDP型Rab27aとその結合タンパク質であるIQGAP1が、インスリン顆粒膜のエンドサイトーシスを制御する分子メカニズムを、以下に従って解明する予定である。平成23年度：GDP型Rab27aとIQGAP1の結合を評価する。平成24年度：その結合を制御するメカニズムを解析する。平成25年度：GDP型Rab27aと結合したIQGAP1がエンドサイトーシスに果たす役割を検討する。 本年度は、GDP型Rab27aとIQGAP1の結合様式を生化学的な手法により明らかにした。従って、本年度の研究計画は、当初の計画以上に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
IQGAP1のリコンビナントタンパク質は、当初予定していた大腸菌からではなく、バキュロウイルスを用いて昆虫細胞より精製した。そのため、次年度使用額が生じた。当該研究費は、翌年度以降の研究費と共に、IQGAP1のリン酸化や非リン酸化をmimicしたコンストラクトの作製にあてる予定である。 平成24年度は、前年度の成果を基盤にIQGAP1の活性制御機構を検討する。1. セカンドメッセンジャーによる活性制御機構を調べる。具体的には、様々な分泌調節物質を用いてセカンドメッセンジャーを増減させたMIN6細胞を用いて免疫染色法と免疫沈降法を行い、IQGAP1の細胞内局在変化やGDP型Rab27aとの結合を調べる。2. IQGAP1はプロテインキナーゼCのnovel typeのアイソフォームであるPKCεを含め様々なプロテインキナーゼによってリン酸化される(JBC,280,13871-13878,2005)。そこで、GDP型Rab27a結合部位付近のリン酸化が結合に及ぼす影響を調べる。具体的には、IQGAP1のリン酸化や非リン酸化をmimicした変異体を作製し、免疫沈降法を行う。3. IQGAP1は、Rac1やCdc42のGTP型と結合する。そこで、Rac1やCdc42がIQGAP1とGDP型Rab27aとの結合に及ぼす影響を調べる。具体的には、これらの低分子量Gタンパク質をGTP型又はGDP型に固定した変異体を作製し、免疫沈降法と精製タンパク質を用いた結合実験を行う。4. 上記のIQGAP1やRac1/Cdc42の変異体をMIN6細胞に発現させ、細胞内動態をタイムラプス顕微鏡で解析する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
1. 必要な設備は、すべて大分大学に設置されているので設備備品の申請は行わない。2. 消耗品は、実勢価格を参考にして60万円を計上した。Rab27aとの結合を評価する際にタンパク質や抗体の精製が必要であると考え、生化学関連試薬に消耗品の40%の予算を割り当てた。一方、MIN6細胞では導入率の高い遺伝子導入試薬を用いて様々なタンパク質を発現させる必要がある点から、細胞培養の試薬と器具にそれぞれ消耗品の40%と20%の予算を割り当てた。3. 旅費は、分子生物学会、薬理学会、糖尿病学会への出席・発表のために、旅行社の見積額を参考にして20万円を計上した。4. 謝金は、外国語論文の校閲にあてるために、過去の実績に基づいて15万円を計上した。5. その他は、本研究成果の論文による公表のため印刷費、投稿料を過去の実績に基づいて5万円を計上した。
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