2011 Fiscal Year Research-status Report
造血幹細胞におけるＤｌｋ１ーＤｉｏ３領域のｍｉｃｒｏＲＮＡ群の機能解析
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23791075
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
山本 玲 東京大学, 医科学研究所, 特任研究員 (00581191)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | 造血幹細胞 / 自己複製能 / 多分化能 / microRNA |
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| Research Abstract |
造血幹細胞は、自己複製能・多分化能という特徴的な機能を有している。その機能におけるmicroRNAの役割は不明な点が多い。また、マウス造血幹細胞画分(CD34-KSL)は、CD150の発現が高いほど自己複製能が高いことが知られている。そこで、本年度は、マウス造血幹細胞画分(CD34-KSL)をCD150の発現強度（高・中・低）により、３画分に細分化し、それぞれのmicroRNAの発現解析を行った。その解析により、CD150高発現画分に高発現するmicroRNA群を複数個抽出し、それぞれのmicroRNA発現レトロウイルスベクターを作製した。それらのベクターを分取した造血幹細胞に感染導入を行い、in vitroでのコロニーアッセイを行った。分化能に関しては、差を認めるmicroRNAが観察されたが、多分化能の指標であるnmEMコロニー形成能には差が認められなかった。さらに、microRNA導入造血幹細胞を致死量放射線を照射したマウスに競合細胞とともに移植を行った。その後、定期的に末梢血のキメリズム解析を行った。コントロール群と比較して有意にキメリズム上昇するmicroRNAは同定できていないが、高い傾向を示す複数個のmicroRNAが確認された。これらのmicroRNAは比較的狭い領域内でclusterを作ることが知られており、複数のmicroRNAが共同で作用することが考えられ、複数のmicroRNAを含んだ発現ベクターを作製、さらに移植実験を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
microRNAは、クラスターを形成することがあり、単体microRNAで大きな影響が出ないことも予想されている。本研究でも、単体microRNAでは、有意に自己複製能を増強するmicroRNAは同定出来ていない。しかし、有意ではないが自己複製能に関与する可能性のあるmicroRNA群の候補は絞られてきており、今後、複数のmicroRNAを同時に強制発現できるベクターを用いて、移植実験によりスクリーニングを行い、その同定が可能であると期待される。また、in vitroの実験で血球の分化指向性に影響を与える可能性のあるmicroRNAをスクリーニングすることができた。これらのmicroRNAに関しては、マウス造血においてin vivoにおける分化能への影響に関してさらなる解析を行う。マウス造血幹細胞の自己複製・多分化能に重要であると推測されるmicroRNAの同定につながるものと期待されうるものである。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、複数のmicroRNAを含んだ発現レトロウイルスベクターを作製し、それらを用いた移植実験を行う予定である。そのスクリーニングが終了次第、そのターゲット遺伝子の探索を行う。その方法としては、データベースの利用(miRBaseなど)・候補microRNAを未分化造血細胞株EMLに導入し比較した遺伝子発現アレイを行う。以上のアプローチで得られたmiicroRNAのターゲット候補遺伝子におけるmicroRNAの結合領域をクローニングし、ルシフェラーゼベクターに組み込む。microRNA導入によるルシフェラーゼ活性を測定し、microRNAにより制御されている遺伝子を同定する。また、通常のLy5.1/Ly5.2マウスシステムを用いた移植実験系では白血球の分化能の影響のみしか評価できない。本研究では、in vitroのコロニーアッセイにおいて赤血球・巨核球分化に影響を与える可能性が考えられるmicroRNAが認められており、それをin vivoの系で評価する必要が考えられる。そこで、通常のLy5.1/Ly5.2マウスシステムではなく、赤血球・血小板もともに蛍光蛋白によりマーキングされたマウスをドナー細胞として、そのmicroRNAの機能解析を移植実験によって確認をする予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本研究の遂行に当たっては、設備（フローサイトメーター・定量PCR解析装置など）は既に稼働しており、研究費はすべて消耗品及び研究成果の発表・他の研究者との情報交換のための学会発表の旅費に充てられる。遺伝子解析用としてルシフェラーゼアッセイ試薬(100千)・遺伝子導入関連試薬(150千)・遺伝子発現アレイ(200千x 4 = 800千), B6マウス(1.5千x 200匹= 300千)、モノクローナル抗体(20千x 15本 = 300千)、サイトカイン(2千x 10本 = 200千)、培養用血清・培地(300千円)、培養用消耗品(100千円)として算出した。
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Research Products
(4 results)
