Ｔｏｌｌーインターロイキン１受容体ドメインの結合特異性を利用した免疫抑制法の開発

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23791161
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 大西 秀典 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60381620)
• Keywords: 自然免疫

Research Abstract

本研究では、自然免疫を担う中心的受容体であるToll様受容体(TLR)シグナル伝達及びサイトカインIL-1/18/33のシグナル伝達経路を対象としたタンパク構造及び機能解析を通じて、自己炎症性症候群や慢性炎症性疾患等の免疫異常疾患に対する効果的な治療法開発への道を開くことを目指している。
具体的にはアダプター分子MyD88を標的とし、MyD88と相互作用する受容体群及びアダプター分子群のToll-Interleukin-1受容体(TIR)ドメインとの直接相互作用を詳細に解析し、IL-1ファミリー/TLRシグナルの流れを遮断・調節するような薬剤候補物質を開発することになる。
平成23年度には、細胞内タンパクであるMyD88の優性阻害変異型(DN)を細胞内に外部から浸透させるためのドメイン(Protein transduction domain, PTD)を融合したPTD-MyD88-DNを大腸菌タンパク発現系で発現精製させることに成功しているが、エンドトキシンの夾雑によりこのタンパクの機能評価が困難であった。そこで、機能評価の検討方法としてTLR1及びTLR2、NF-κB reporter gene遺伝子が安定発現した細胞株を新たに導入した。また、MyD88-TIRタンパクが非還元環境ではドメイン構造の表面露出したシステインを介してS=S結合により多量体を形成してしまうことが判明したため、システインをセリンに置換したC203S-C280S(CS)変異体を構築した。
MyD88-DN-CSは非還元環境でも単量体で存在することが確認できた。一方で、MyD88-DN-CSは遺伝子レベルでは、Pam3CSK4によるTLR1/2シグナル経路の活性化を有意に抑制するが、PTD-MyD88-DN-CSタンパクを添加したところ、リガンド非依存性にNF-κB活性の上昇が認められた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Protein transduction domain融合MyD88優性阻害型タンパクを安定に発現精製可能な実験系が確立され、さらにCS変異体により安定な単量体タンパクが大量に精製できている。多量体化の抑制によりエンドトキシンの夾雑も大幅に削減できた。しかし一方で、予想外のことに作成したPTD-MyD88-DN-CSタンパクが遺伝子レベルの発現系と異なる挙動を示している。次年度以降はこの問題点について追求していく。

Strategy for Future Research Activity

次年度以降、遺伝子レベルの発現系とタンパクレベルの細胞導入の表現型の違いが何に起因するものか追求する予定である。具体的には細胞に導入されるタンパクの局在が異なるのではないかと考えている。遺伝子レベルの発現系及びリコンビナントタンパクにGFP等の蛍光タンパクを融合させ、局在を確認する予定である。また、MyD88を標的とした阻害剤の開発には遺伝子レベルの発現と同様の部位へのタンパク導入が必要であり、使用するPTDの変更も視野に入れる。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

該当なし

Research Products

• [Journal Article] In vitro analysis of the functional effects of an NLRP3 G809S variant with the co-existence of MEFV haplotype variants in atypical autoinflammatory syndrome. (2013)
  • Author(s): Kubota K, Ohnishi H, Teramoto T, Matsui E, Murase K, Kanoh H, Kato Z, Kaneko H, Seishima M, Kondo N
  • Journal Title: J Clin Immunol Volume: 33 Pages: 325-334
  • DOI: 10.1007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Autosomal-dominant chronic mucocutaneous candidiasis with STAT1-mutation can be complicated with chronic active hepatitis and hypothyroidism. (2012)
  • Author(s): Hori T, Ohnishi H, Teramoto T, Tsubouchi K, Naiki T, Hirose Y, Ohara O, Seishima M, Kaneko H, Fukao T, Kondo N.
  • Journal Title: J Clin Immunol Volume: 32 Pages: 1213-1220
  • DOI: 10.1007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] TRAM is involved in IL-18 signaling and functions as a sorting adaptor for MyD88. (2012)
  • Author(s): Ohnishi H, Tochio H, Kato Z, Kawamoto N, Kimura T, Kubota K, Yamamoto T, Funasaka T, Nakano H, Wong RW, Shirakawa M, Kondo N.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 7 Pages: e38423
  • DOI: 10.1371
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular analysis of the binding mode of Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain proteins during TLR2 signaling (2012)
  • Author(s): Nada M, Ohnishi H, Tochio H, Kato Z, Kimura T, Kubota K, Yamamoto T, Kamatari YO, Tsutsumi N, Shirakawa M, Kondo N.
  • Journal Title: Mol Immunol. Volume: 52 Pages: 108-116
  • DOI: 10.1016
  • Peer Reviewed