2011 Fiscal Year Research-status Report
ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞に由来する骨格筋幹・前駆細胞の分離技術の確立
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23791170
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
粟屋 智就 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20589593)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | 骨格筋分化 / ヒト胚性幹細胞 / ヒト誘導多能性幹細胞 / 疾患特異的iPS細胞 / 筋ジストロフィー / 再生医療 |
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| Research Abstract |
本研究は、ヒト胚性幹(ES)細胞および誘導多能性幹(iPS)細胞を用いた骨格筋前駆細胞の分離同定とその移植における効果の検証を目的としている。具体的には(1)ヒト ES/iPS 細胞のin vitroでの骨格筋細胞への分化誘導系からの骨格筋幹/前駆細胞の表面抗原による分離同定、(2)抽出した骨格筋幹/前駆細胞の免疫不全マウスへの移植によるin vivoでの挙動の解析および組織再構成能の評価、を目標とした。今年度は主に(1)の項目について検討するため、ヒトES細胞およびiPS細胞をin vitroで骨格筋細胞へと分化させ、その中間過程を経時的な表面抗原解析等を用いて検討した。それにより骨格筋分化能をもつ骨格筋前駆細胞がCD73およびCD56を発現する細胞群に主として存在することが示唆された。RT-PCR法による骨格筋決定因子等の発現からも同様の結果が得られた。しかしながらCell sortingを用いた手法ではCD73/CD56共発現細胞群は十分なin vitroでの骨格筋分化能を示さず、何らかの阻害要因があることが考えられた。そこで培養法を検討し、Cell sortingを用いずに一定の条件下で培養すると、比較的均一なCD73/CD56共発現細胞が得られ、効率的に骨格筋分化を示すことが確認できた。現在はそれらの細胞を用いたin vivoでの骨格筋分化能の検証を行っている。また、これらの研究を筋疾患に応用するため、並行してDuchenne型筋ジストロフィー症をはじめとする複数の筋疾患患者より、疾患特異的iPS細胞の樹立を開始した。今後はこれらの細胞を用いた比較検討のため、予備的作業としてiPS細胞の品質評価等を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞より骨格筋細胞を誘導することは出来たが、そこからCell Sorting を用いて分離したCD73/CD56共発現細胞群は十分なin vitroでの骨格筋分化能を示さなかった。そのため、当初の予定と比して培養法の変更・改善に労力が割かれた。しかしながら結果として、一定の条件下で比較的均一なCD73/CD56共発現細胞が得られ、効率的に骨格筋分化を示すことを確認出来た。現在はこれらの細胞を用いたin vivoでの骨格筋分化能の検証を行っており、おおむね当初の予定通り進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初、次年度に予定していた(2)抽出した骨格筋幹/前駆細胞の免疫不全マウスへの移植によるin vivoでの挙動の解析および組織再構成能の評価、については現在進行中である。しかしながら、細胞株によっては(1)で用いた分化効率に多大な差異があり、また培養に比較的長期間かかることも今後の研究展開へ支障を来している。これらのことより、より短時間で効率的に骨格筋系譜の細胞を分化誘導する手法の開発を並行して行う予定である。また、実際にこれらの技術を筋疾患に応用するため、Duchenne型筋ジストロフィー症をはじめとする複数の筋疾患患者より、疾患特異的iPS細胞の樹立を開始している。これらの細胞を実際に使用するにあたり、次年度は予備的作業としてiPS細胞の品質評価等を行う予定である。今回の当初の研究計画には、疾患特異的iPS細胞を用いた疾患研究までは含めていないが、進行の度合いによってはこれらの細胞を取り入れ、今後の研究の発展の礎とすることとする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
昨年度は比較的安価な培養条件を確立し、研究費を次年度に繰り越すことが出来た。本年はin vivoでの移植実験を中心として行うため、前記の培養に関わる諸費用に加えて動物系統維持、移植組織解析のための抗体、試薬などの費用が必要となる。また、前年度に引き続き培養系の改良および上述の基礎検討を必要とするため、培養機器およびサイトカインなどの費用が必要となる。概算として、培養用メディウム250,000 円、及び培養用プラスチック製品250,000 円、分化誘導システムの向上のためサイトカインを500,000円計上し、その他、骨格筋分化の評価のためのフローサイトメトリー、免疫組織染色のための各種抗体費用500,000円、RT-PCR解析のためのRNA抽出キット、cDNA合成試薬、PCRプライマー等の費用を700,000円、免疫不全マウス維持費用のため100,000 円を計上した。
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