Ｏｌｉｇ２陽性細胞から選択的に誘導したニューロンを用いた神経再生医療の基礎的検討

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23791605
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 政平 訓貴 高知大学, 医療学系, 助教 (80444769)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2013-03-31
• Keywords: 再生医療 / Olig2 / 神経分化 / オリゴデンドロサイト / 運動ニューロン

Research Abstract

神経再生を目的に神経幹細胞移植が期待されているが、現在のところ移植された幹細胞がどのような神経細胞を生み出すかは、移植された環境に左右されるため安定した効果が見込めない。Olig2は神経発生においてニューロン系とグリア系の特定のクラスへの分化を決定付けるユニークな転写因子である。この性質を利用し、神経幹細胞から目的とするニューロンおよびグリアを特異的に分化誘導させて移植医療を効率的に安定して行えることを目的とする。Olig2陽性細胞は他の転写因子と共同して運動ニューロン、オリゴデンドロサイトへの分化を決定すると考えられているが、その制御機構は解明されていない。そこでまず、マウス胎仔脊髄から運動ニューロンの産生前の時期のOlig2陽性細胞と、運動ニューロンを産生中の時期のOlig2陽性細胞を採取し、転写因子の発現パターンを比較することにより運動ニューロン産生に関わる遺伝子をスクリーニングする。その準備として単一のOlig2陽性細胞を採取し、個々のOlig2陽性細胞からどのような細胞が生み出されるのかを調べるため、Olig2の発現が始まる胎生9.5日の脊髄腹側部分の組織を集め、ホモジネートしOlig2抗体を用いて、セルソーターでOlig2陽性細胞のみを採取することを試みており、Olig2抗体およびマウスや試薬の調整やセルソーターの条件設定を行っている。ある程度細胞が得られたら限界希釈法にて、1細胞/1 wellの状態に単離して単一のOlig2陽性細胞からどのような細胞が生み出されるかを調べる予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

胎生9.5日のマウスから得られる脊髄腹側の組織は当初の予想外にわずかであり、必要とする量の組織を集めるには多くの個体数が必要で調達に時間がかかっている。また、Olig2抗体の染色条件が安定せず、予想したような結果が得られていない。現在その条件検討をつきつめながら、次の段階であるOlig2陽性細胞培養のための準備を進めている状況である。

Strategy for Future Research Activity

胎生9.5日の脊髄腹側部分の組織を集めホモジネートし、Olig2抗体を用いてセルソーターでOlig2陽性細胞のみを採取する。得られたら細胞を限界希釈法にて、1細胞/1 wellの状態に単離して単一のOlig2陽性細胞からどのような細胞が生み出されるかをニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイトなどに特異的なマーカーで抗体染色して、単一の細胞集団へ分化するのか、ヘテロな集団として分化するのかを調べる。次の段階としては、Olig2陽性細胞から運動ニューロンへと分化させる因子を同定するため、様々な胎生期のOlig2陽性細胞を同様の手法で採取し、それぞれの遺伝子発現プロファイルをDNA microtipで比較したり、subtraction法を用いることによって、MNへの分化に働く因子をスクリーニングする。最終的には、得られた候補の分化因子を強制発現サイトに導入したレトロウイルスベクターを、Olig2陽性細胞に感染させて分化させる。細胞マーカーで免疫染色を行い、予想される細胞種への特異的分化が得られるかどうかを評価する予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

平成23年度の計画に基づく経費執行について、4月に支払いすべき経費が残っているため、次年度使用額が存在するように見えるが、実際には、全額を執行予定である。そのため、次年度の研究は、当初の計画通り進める予定である。