Ｓｏｘ９－ＣｒｅＥＲＴ２マウスを用いた脊椎椎間板症の病態解明と新規治療薬の開発

2012 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 23791637
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 宗 和隆 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30514038)
• Keywords: TGF-beta / 椎間板 / 低分子化合物

Research Abstract

平成２４年度は、生後１～３日のTGFBR-II flox/floxマウスの肋軟骨を摘出し、トリプシンおよびコラゲナーゼにて軟骨細胞を単離した。９６ウェル培養プレート１ウェルあたり5x104個の細胞を播種しα-MEM培地で２４時間培養し、Adenovirus-CreをMOI=5となるように各ウェルに添加し感染させ、さらに４８時間培養しTGFBR-II遺伝子を欠失した軟骨細胞を作製した。α-MEM培地を交換後、各ウェルに合成低分子化合物を最終濃度10-6Mとなるように添加し、さらに４８時間培養する。各ウェルの硫酸化グリコサミノグリカン量は、プロテアーゼを用いて消化後DMMB色素液で発色させ吸光度530nmで比色定量した。コントロールとしてDMSO添加ウェルを作製しておき、コントロールと比べて３倍以上の硫酸化グリコサミノグリカン産生を誘導する化合物をヒット化合物としてスクリーニングとした。現在まで約2000種類の低分子化合物をスクリーニングしたものの、いまだヒット化合物を得られていない。また、２次スクリーニング用として、日本白色家兎の椎間板からコラゲナーゼ処理にて初代髄核細胞の単離を試みているが、現在まで、スクリーニングに十分量の椎間板髄核細胞の単離に成功しておらず、単離条件の検討中である。