2011 Fiscal Year Research-status Report
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23792014
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
五十嵐 勉 日本医科大学, 医学部, 講師 (10421190)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | 遺伝子 / ウィルスベクター / 眼科 / 網膜 / 新生血管 |
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| Research Abstract |
マウスにおける各遺伝子(VEGF, HIF, CCR3)に対するsiRNAの配列について検討し、具体的には各遺伝子を発現する培養細胞株に対する遺伝子発現抑制について多種ある配列の中からRNAレベルにて検討を行い、デザインの決定を行った。 選択された配列の遺伝子をAAV type8ベクターのベクタープラスミド(発現したい遺伝子をコード)に挿入した。ライゲーション、トランスフォーメーションを行って、クローンの単離を行った。クローンのシークエンスを確認し、プラスミドを精製後、発現を培養細胞にて確認後、AAV type8ベクターを作製した。次にAAV type8ベクターの発現を培養細胞にて確認後、ラージスケールにてベクターを作製し濃縮を行った。 また予備実験として、投与方法の検討を行った。マーカー遺伝子(EGFP, Luc)を発現するAAV type8ベクターを結膜下、硝子体、網膜下へ投与し、経時的に病理学的、電機生理学的、またIVISという屠殺しなくても同じ個体で遺伝子発現を観察できる系を用いて発現パターン、発現強度、多臓器への影響を検討した結果、結膜下は遺伝子発現が弱く、１年後においても硝子体、網膜下にはほぼ差がなく強発現していることが分かった。さらに網膜下投与は投与自体が網膜の障害になることをHE染色、GFAP染色、ERGにおいて示した。全身へのベクターの散布としては、結膜下投与の場合、肝臓において有意に上昇していたが、１ヶ月後ほぼ消失していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
(1)ターゲットとなるsiRNAの選択 マウスにおける各遺伝子(VEGF, HIF, CCR3)に対するsiRNAの配列について検討する。具体的には各遺伝子を発現する培養細胞株に対する遺伝子発現抑制について多種ある配列の中からRNAレベルにて検討を行い、デザインの決定を行った。(2)AAV type8ベクターを構築 選択された配列の遺伝子をAAV type8ベクターのベクタープラスミド(発現したい遺伝子をコード)に挿入する。ライゲーション、トランスフォーメーションを行って、クローンの単離を行う。クローンのシークエンスを確認し、プラスミドを精製後、発現を培養細胞にて確認後、AAV type8ベクターを作製する。次にAAV type8ベクターの発現を培養細胞にて確認後、ラージスケールにてベクターを作製し濃縮を行い、ウイルスベクターの力価を測定し、濃縮率を決定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
I．加齢性黄斑変性モデルに対してベクターを投与し新生血管抑制効果、副作用の解明;(1)レーザーモデルを作製:アルゴンレーザー照射を成人C57BLマウスの網膜に行う。条件としては0.1秒、100μm、100mWにて視神経乳頭周囲に４カ所レーザー照射を行う。(2)AAV type8ベクターの投与:一般的に網膜下へ投与を行うが上記の学術的背景にも記載した通り、我々は硝子体投与もかなりの効率で遺伝子導入を行えることを確認している。この研究により投与方法の変更が行われる可能性もあり得るが、投与時期に関してはレーザー照射後すぐに投与を行う予定である。(3)脈絡新生血管の評価:新生血管測定用には、生理食塩水で還流後4%パラホルムアルデヒドで固定し、フルオレセイン標識のデキストランを還流し血管の可視化を行う。眼球を摘出し固定液内で固定を行う。眼球を前眼部と後眼部に分け、後眼部を神経網膜と色素上皮細胞、脈絡膜、強膜に分け、フラットマウントを作製する。蛍光顕微鏡下にて新生血管の範囲を計測し、コントロールのベクターとの比較を行う。(4)病理解析:生理食塩水で還流後4%パラホルムアルデヒドで固定し、眼球を摘出し固定を行う。シュクロースで置換した後、眼球を前眼部と後眼部に分け、凍結を行い、切片を作製する。抗体としてはVEGF, CCR3, CCR3のリガンドであるCCL11, CCL24, CCL26の発現を検討し、ベクター投与によりどのような影響があるか解析を行う。(5)RNAレベルでの解析:病理解析で調べるVEGF, CCR3, CCL11, CCL24, CCL26の発現がタンパクのレベルと同様であるか、RNAのレベルでも検討する。また血管新生に関連する遺伝子を網羅的に解析するため、RNAを抽出し、RNAアレイにより解析を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
現在、計画通りに進んでおり、当初の計画通り次年度も行いう。
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